Models of recruitment of aircrews through temporary work agencies and other

Com o objetivo de determinar se os hAMPE induziam a morte por apoptose ou necrose nas células das linhas celulares de carcinoma hepatocelular, recorreu-se à utilização da anexina V e do iodeto de propídeo, respetivamente.

As células eucarióticas mantêm uma distribuição assimétrica dos fosfolípidos entre o folheto interno e o folheto externo da membrana plasmática. Sabe-se atualmente que a perda de assimetria e a consequente alteração da distribuição dos fosfolípidos na bicamada lipídica, sem alteração da integridade da membrana plasmática, é um evento desencadeado pela apoptose celular. Desta forma, quando se inicia a morte celular por apoptose, ocorre a translocação da fosfatidilserina, um fosfolípido de carga negativa, do folheto interno para o folheto externo da membrana celular, como ilustrado na figura 3.3. A anexina V é uma molécula com elevada afinidade por fosfolípidos de carga negativa, como a fosfatidilserina, ligando-se a esta. Quando conjugada com um fluorocromo, a anexina V permite determinar a localização da fosfatidilserina na membrana celular e assim identificar as células em apoptose (Engeland et al. 1998; Elmore 2007).

Figura 3.3 – Deteção da apoptose com recurso à anexina V. Durante a apoptose, ocorre a translocação da fosfatidilserina do folheto interno para o folheto externo da membrana celular, ficando desta forma exposta à anexina V (AnV) conjugada com um fluorocromo (FITC), que permite detetar e identificar as células em apoptose. Adaptado de Servier.com (Creative Commons Attribution 3.0 Unported License, disponível em http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).

Para determinar se os hAMPE induziam a morte por apoptose nas células das linhas

celulares de carcinoma hepatocelular HuH7, HepG2 e Hep3B2.1-7, 1x106 _{células foram}

incubadas com 1μg/µL de hAMPE durante 72 horas. Após este período de incubação, as células foram tripsinizadas, centrifugadas a 1300xG durante 5 minutos e lavadas com PBS por centrifugação segundo o programa anteriormente referido. Posteriormente, as células foram incubadas durante 15 minutos no escuro com 100µL de tampão de ligação constituído por

0,01M de N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanossulfónico) (HEPES - Sigma, H7523), 0,14M de cloreto de sódio e 0,25mM de cloreto de cálcio (Sigma, C4901) e por 2µL de anexina V conjugada com o fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC, do inglês fluorescein

isothiocyanate – Immunostep, ANXVF). Após lavagem celular com PBS por centrifugação a

1300xG durante 5 minutos, 200µL de tampão de ligação foram adicionados às células e a fluorescência foi avaliada recorrendo a um comprimento de onda de excitação de 485/20nm e a um comprimento de onda de emissão de 528/20nm, utilizando para tal um leitor de placas multi-deteção. O ensaio foi realizado com células incubadas na ausência (controlo) e na presença dos hAMPE.

Por outro lado, com o objetivo de determinar se os hAMPE induziam a morte por necrose nas células das linhas celulares de carcinoma hepatocelular, recorreu-se à utilização do iodeto de propídeo. O iodeto de propídeo é um agente que é incapaz de permear as células viáveis devido à integridade da membrana celular. Quando a morte celular ocorre por apoptose tardia ou por necrose, a integridade da membrana celular fica comprometida e o iodeto de propídeo penetra nas células, intercalando-se aleatoriamente nos pares de bases constituintes da dupla cadeia de ADN, sendo a sua fluorescência largamente amplificada, tal como descrito na figura 3.4 (Abrantes et al. 2010; Vitale et al. 1993; Cevik & Dalkara 2003).

Figura 3.4 – Deteção da necrose com recurso ao iodeto de propídeo. Durante a necrose, o iodeto de propídeo (IP) penetra nas células, intercala-se no ADN e a sua fluorescência é amplificada. Adaptado de Servier.com (Creative Commons Attribution 3.0 Unported License, disponível em http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).

Desta forma, para determinar se os hAMPE induziam a morte por necrose nas células das linhas celulares de carcinoma hepatocelular HuH7, HepG2 e Hep3B2.1-7, 1x106 _células

foram incubadas com 1μg/µL de hAMPE durante 72 horas. Após este período de incubação, as células foram tripsinizadas, centrifugadas a 1300xG durante 5 minutos e lavadas com PBS por centrifugação segundo a metodologia anteriormente descrita. Posteriormente, as células foram incubadas durante 15 minutos no escuro com 100µL de tampão de ligação e 1µL de

iodeto de propídeo (Immunostep). Após lavagem com PBS por centrifugação a 1300xG durante 5 minutos, 200µL de solução tampão de ligação foram adicionados às células e a fluorescência foi determinada com um comprimento de onda de excitação de 485/20nm e um comprimento de onda de emissão de 590/35nm, utilizando para tal um leitor de placas multi-deteção. O ensaio foi realizado com células incubadas na ausência (controlo) e na presença dos hAMPE.

3.4.3 Vias de morte celular

BAX e BCL2

Com o objetivo de determinar se os hAMPE induziam a alteração da expressão das proteínas BAX e BCL2 nas células das linhas celulares de carcinoma hepatocelular HuH7, HepG2 e Hep3B2.1-7, recorreu-se à utilização de anticorpos específicos contra as proteínas de interesse através da técnica de imunofluorescência.

Para tal, 1x106 _{células foram incubadas com 1μg/µL de hAMPE durante 72 horas. Após}

este período de incubação, as células foram tripsinizadas, centrifugadas a 1300xG durante 5 minutos e lavadas com PBS por centrifugação segundo a metodologia previamente descrita. Posteriormente, as células foram incubadas durante 15 minutos com 100µL de solução de fixação (IntraCell, Immunostep). Após nova lavagem com PBS por centrifugação durante 5 minutos a 1300xG, adicionaram-se às células 100µL de solução de permeabilização (IntraCell, Immunostep) assim como o anticorpo primário anti-BAX conjugado com o fluorocromo ficoeritrina (PE, do inglês phycoerythrin; 1:50 - Santa Cruz Biotechnology, sc-20067) ou o anticorpo primário anti-BCL2 conjugado com o fluorocromo FITC (1:50 - Santa Cruz Biotechnology, sc-509). As células foram depois incubadas durante 15 minutos no escuro. Após lavagem com PBS por centrifugação a 1300xG durante 5 minutos, foram adicionados 200µL de PBS às células e estas foram posteriormente excitadas com uma luz com comprimento de onda de 485/20nm. Para a deteção da fluorescência, foram utilizados os comprimentos de onda de emissão de 590/35nm para o PE e de 528/20nm para o FITC, utilizando para tal um leitor de placas multi-deteção. O ensaio foi realizado com células incubadas na ausência (controlo) e na presença dos hAMPE.

Citocromo C

Com o objetivo de determinar se os hAMPE induziam a alteração da expressão do citocromo C nas células das linhas celulares de carcinoma hepatocelular HuH7, HepG2 e Hep3B2.1-7, recorreu-se à utilização de um anticorpo específico contra a proteína de interesse através da técnica de imunofluorescência.

Para tal, 1x106 _{células foram incubadas com 1μg/µL de hAMPE durante 72 horas. Após}

este período de incubação, as células foram tripsinizadas, centrifugadas a 1300xG durante 5 minutos e lavadas com PBS por centrifugação segundo o programa anteriormente referido. Posteriormente, as células foram incubadas durante 15 minutos com 100µL de solução de fixação. Após lavagem com PBS por centrifugação a 1300xG durante 5 minutos, adicionaram- se às células 100µL de solução de permeabilização e o anticorpo primário anti-citocromo C conjugado com o fluorocromo FITC (1:50 - Santa Cruz Biotechnology, sc-13561) ficando em incubação, no escuro, durante 15 minutos. Após lavagem com PBS por centrifugação a 1300xG durante 5 minutos, 200µL de PBS foram adicionados às células e estas foram posteriormente excitadas com uma luz de comprimento de onda de 485/20nm. Para deteção da fluorescência, foi utilizado o comprimento de onda de emissão de 528/20nm, utilizando para tal um leitor de placas multi-deteção. O ensaio foi realizado com células incubadas na ausência (controlo) e na presença dos hAMPE.