O limite de quantificação representa a menor concentração da substância em exame que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental. Os critérios para calcular o LOD podem ser adotados para calcular o LOQ, ou seja, o LOQ pode ser calculado utilizando o método visual, o método sinal-ruído (normalmente 10:1) e o método baseado em parâmetros da curva analítica, sendo este estatisticamente mais confiável.49
3.5.7. Robustez
A robustez de um método corresponde à capacidade deste não ser afetado por uma pequena variação em seus parâmetros. A robustez de um método cromatográfico é avaliada pela variação dos parâmetros operacionais e a provável determinação dos seus efeitos (se houver) sobre os resultados a serem obtidos com a metodologia. Diz-se que um método é robusto quando ele não é afetado por uma modificação pequena e deliberada em seus parâmetros. As mudanças introduzidas refletem as alterações que podem ocorrer quando um método é transferido para outros laboratórios, analistas ou equipamentos.49
3.6. Métodos Quimiométricos
Com o desenvolvimento da microeletrônica e a popularização dos microcomputadores, ocorreu um avanço significativo nas análises químicas instrumentais que possibilitou a aquisição de maneira fácil e rápida de um grande número de dados de uma mesma amostra. Consequentemente, o tratamento desses dados passou a exigir modelos mais complexos que vão além dos tradicionais métodos estatísticos univariados.55
Hoje, a utilização de métodos multivariados a dados químicos está bem difundida e aceita pela comunidade científica, consistindo uma área denominada quimiometria. A quimiometria não é uma disciplina da matemática, mas sim da química, isto é, os problemas que ela se propõe a resolver são de interesse e originados na química, ainda que as ferramentas de trabalho provenham principalmente da matemática, estatística e computação. Muita ênfase tem sido dada aos sistemas multivariados, nos quais se pode medir muitas variáveis simultaneamente, ao se analisar uma amostra qualquer. Nesses sistemas, a conversão da resposta instrumental no dado químico de interesse requer a utilização de técnicas de estatística multivariada, álgebra matricial e análise numérica. Essas técnicas se constituem no momento na melhor alternativa para a interpretação de dados e para a aquisição do máximo de informação sobre o sistema.
As ferramentas quimiométricas empregam métodos matemáticos e estatísticos para planejar ou selecionar experimentos de forma otimizada e para fornecer o máximo de informação química com a análise dos dados obtidos. Atualmente a quimiometria já é suficientemente estabelecida e de uso disseminado para que justifique sua introdução em cursos regulares da área de química e áreas afins.56
3.6.1. Planejamentos Experimentais
Com o advento da quimiometria, o uso de experimentos estatisticamente planejados cresceu rapidamente em vários campos de pesquisa no Brasil, especialmente química, engenharia química, engenharia de alimentos e biotecnologia. Os planejamentos experimentais mais usados no Brasil são os fatoriais, completos ou fracionários, e os planejamentos compostos centrais. Exemplos de utilização destes métodos são amplamente encontrados em revistas científicas.59
A maioria dos planejamentos baseados em princípios de estatística multivariada envolve de uma meia dúzia até varias dezenas de experimentos. É recomendável que os experimentos sejam executados em ordem aleatória, para se obter uma estimativa confiável da extensão do erro experimental. No entanto, químicos ou engenheiros muitas vezes trabalham com fatores que são difíceis de variar frequentemente. Mudar os níveis desses fatores cada vez que um experimento fosse executado poderia inviabilizar um projeto experimental ou causar demoras inaceitáveis na obtenção de resultados. Problemas deste tipo podem ser abordados com planejamentos do tipo lote repartido (split-plot), que permitem que variáveis difíceis de ajustar sejam mudadas em ordem aleatória somente em blocos de experimentos, enquanto os níveis dos fatores menos problemáticos são variados em ordem aleatória para todos os experimentos. Este procedimento facilita os aspectos operacionais no laboratório, mas tem seus inconvenientes. A estatística envolvida na análise dos dados é bem mais complexa que a dos planejamentos com ensaios feitos em ordem totalmente aleatória. Planejamentos split-plot têm sido muito empregados em estudos agrícolas para os quais, aliás, foram inventados, o que explica a terminologia. O "lote repartido", originalmente, era um lote de terreno. Quase todos esses estudos, porém, se limitam a fazer uma análise da variância (ANOVA) dos dados experimentais. Para um químico, normalmente é mais interessante ir além da ANOVA e desenvolver um modelo mostrando como os resultados da pesquisa ou as propriedades do sistema variam em função das mudanças nos níveis dos fatores experimentais.59
No planejamento de qualquer experimento, o primeiro passo é decidir quais são os fatores e as respostas de interesse. Os fatores são as variáveis que o experimentador tem condições de controlar. As respostas de interesse são as variáveis de saída do sistema as quais se está interessado e que serão, ou não, afetadas por modificações provocadas nos fatores.57Dependendo do problema pode-se ter várias respostas de interesse, que talvez devam
ser consideradas simultaneamente, que é o caso da análise de múltiplas respostas em determinações cromatográficas.55, 58-59
Tendo identificado todos os fatores e respostas, a próxima etapa é definir o objetivo que se pretende alcançar com os experimentos para que se tenha condições de escolher o planejamento mais apropriado e a metodologia experimental (tempo, custo, etc.). Objetivos diferentes necessitarão planejamentos diferentes.57, 60
Fatores significativos selecionados após execução de um planejamento adequado de triagem (planejamento fatorial completo ou planejamento fatorial fracionário) podem ser empregados em uma metodologia de análise de superfície de resposta (RSM). Dentre as RSM, os planejamentos Doehlert e composto central (CCD), possivelmente, são os mais utilizados.60
Planejamentos experimentais são muito úteis para otimização das condições operacionais dos procedimentos cromatográficos e de extração. Além disso, outra metodologia quimiométrica de otimização, que emprega algoritmo genético em conjunto com as redes neurais artificiais (abordagem neuro-genética)55,58, pode ser utilizada. Esta abordagem permite a otimização de muitas respostas simultaneamente e nas situações onde ocorre falta de ajuste do modelo de regressão linear múltipla dos planejamentos experimentais.
Não foram encontrados na literatura investigada, até o presente momento, estudos que utilizassem planejamentos experimentais multivariados para determinação de clorpirifós em águautilizando as técnicas de extração/pré-concentração LLE-LTP e HS-SPME, com separação cromatográfica e determinação empregando detector por captura de elétrons e espectrometria de massas.
4. Materiais e Métodos
4.1. Área de EstudoO município de Ouro Branco está localizado na região central do estado de Minas Gerais. O clima predominante é o tropical de altitude, apresentando temperatura mínima em torno de 13 ºC no inverno, com grande estiagem e baixa umidade do ar. No verão apresenta temperatura média em torno de 22 ºC, com altos índices pluviométricos. A vegetação divide- se em três tipos:
(a) cerrado com vegetação rala; (b) remanescente de Mata Atlântica; e
(c) em porções mais elevadas surgem os campos rupestres, adaptados a temperaturas mais baixas.
As principais culturas do município são: 45,6% da área plantada de batata inglesa, 31,7% de milho, 14,3% batata baroa e 8,4% com demais culturas.61
Ouro Branco possui uma população de 35.268 habitantes, dos quais 31.608 residem na zona urbana e 3.659 moram na zona rural.61 É constituída de diversas comunidades rurais (Figura 3) e após as várias visitas de campo e consultas às secretarias, pessoas e órgãos competentes do município, definiu-se as regiões e pontos de coleta alvo do monitoramento proposto neste projeto.
Figura 3. Comunidades rurais (delimitações circulares em cinza) da cidade de Ouro Branco/MG. Fonte: ref. 62.
A área de avaliação deste projeto tem importância significativa no que tange os recursos hídricos, pois, além de fazer parte de duas bacias hidrográficas federais, bacia do Rio Doce e bacia do Rio São Francisco, constituem importante zona de recarga hídrica local e
regional. A parte leste da cidade tem seus recursos hídricos direcionados para a bacia hidrográfica do Rio Doce, enquanto a maior porção das águas do município converge para a bacia do São Francisco, via médio curso do rio Paraopeba.
4.2. Coleta
Os cursos d’água próximos às plantações de batata inglesa foram escolhidos, pois esta cultura tem uma das produções agrícolas mais intensivas e predominantes na utilização de agrotóxicos no município de Ouro Branco.
Por meio de trabalho de campo e consultas às secretarias, pessoas e órgãos competentes do município foi possível identificar os principais bataticultores da zona rural de Ouro Branco bem como as principais plantações de batata inglesa próximas aos cursos d’água. Observou-se também os pontos de escoamento das precipitações, presença de mata ciliar e declividade dos terrenos plantados para se definir os pontos de coleta das amostras de água, georreferenciando tudo com o uso do equipamento de sistema de posicionamento global (GPS). Posteriormente os dados do georreferenciamento foram tratados utilizando o programa ArcGis para confecção do mapa geográfico com os pontos de coleta.
Foram selecionados 10 pontos de coleta, todos em sistemas hídricos superficiais. As coletas foram realizadas nos meses de março e dezembro de 2011, durante o período de alta precipitação pluviométrica, e junho, julho e agosto de 2011, durante o período de estiagem. Intencionou-se com as coletas realizar o monitoramento de clorpirifós nos corpos d’água avaliados, considerando períodos sazonais distintos.
Todas as coletas foram realizadas utilizando recipientes de vidro âmbar de 1 L previamente lavados com o detergente não-iônico Extran 12,5% (v/v) com o auxílio de uma escova, enxaguados exaustivamente com água corrente e, em seguida, enxaguados com quantidade suficiente de água ultrapura para retirar os vestígios de água de torneira. Após esta etapa, todas as vidrarias foram mantidas imersas, durante 24 h, em solução de ácido nítrico (Sigma-Aldrich) 10 % (v/v) e, em seguida, enxaguadas com água ultrapura.
Antes da coleta, os frascos foram enxaguados com a própria água do manancial tendo em vista reduzir a contaminação por fontes externas. As amostras foram coletadas no centro do rio, tendo como referências pontes, a fim de evitar possíveis interferências das margens. A profundidade não foi aferida por se tratar de rios de pouca profundidade. Foram coletados 990 mL de água por ponto de coleta sendo adicionados 10 mL de metanol (Mallinckrodt, grau HPLC) para preservação das amostras. Logo após, as amostras foram armazenadas em caixas
de isopor contendo gelo químico. As mesmas foram transportadas para o Laboratório de Estudos em Quimiometria (LEQ), da Universidade Federal de Ouro Preto, sob coordenação da professora Gilmare Antônia da Silva, e armazenadas sob refrigeração a 4 ºC. Para a filtração das amostras foram usados filtros de diâmetro de poro de 25 e 8 µm de membrana de celulose e filtros de 1,2 µm de fibra de vidro, em um sistema de filtração a vácuo (Figura 4), a fim de eliminar material particulado.
Figura 4. Ilustração do sistema de filtração a vácuo utilizado no trabalho.
4.3. Reagentes e Solventes
O padrão do inseticida clorpirifós de grau de pureza 99,9% foi obtido da Supelco. Foi preparada solução estoque individual de 1000 µg/mL de clorpirifós diluindo-se a quantidade apropriada em acetonitrila (Tedia/HPLC-Spectro). As soluções de trabalho em concentrações adequadas foram obtidas pela diluição da solução estoque e armazenadas a 4ºC. Nos estudos de avaliação da força iônica utilizou-se hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4, Vetec PA 98,5%).