5. RETORISK ANALYSE
5.3.4 Miljørapport
Os níveis de TNF-α aumentaram significativamente após as quatro horas da administração de carragenina (326,4 ± 51,7), entretanto o nerolidol foi capaz de reduzir as concentrações dessa citocina nas doses de 300 e 400 mg/kg em 59,3% (132,9 ± 30,2) e 62,2% (123,4 ± 13,7), respectivamente. A dexametasona (2 mg/kg, s.c.) reduziu em 82% (58,7 ± 8,4) os níveis de TNF-α em relação ao grupo controle (Figura 27).
SAL CONT 300 400 2 0 100 200 300 400
**
**
***
DEXA NERO (mg/kg)T
NF
-
(p
g
/m
L
)
Figura 26 - Efeito da administração do nerolidol (NERO, 200, 300 e 400 mg/kg, p.o.) e da
dexametasona(DEXA, 2 mg/kg , s.c.) sobre os níveis de TNF-α, no modelo de peritonite induzida por carragenina. Cada coluna representa média ± e.p.m (n=8) (ANOVA “one-way” seguido pelo Teste de Dunnett). **p<0,01, ***p<0,001 versus grupo controle.
7. Discussão
As plantas medicinais aromáticas possuem óleos essenciais bioativos que são amplamente utilizados na medicina popular (DE SOUSA, 2011). Vários estudos com óleos essenciais de plantas que possuem o sesquiterpeno nerolidol como constituinte principal apresentaram uma diminuição na nocicepção e inflamação induzida por diversos estímulos (OYEMITAN et al., 2008; PINHEIRO et al., 2011; RADULOVIC et al., 2011; LIMA et al., 2012), porém o composto isolado nunca foi estudado.
Os estudos com o nerolidol iniciaram com a determinação da toxicidade aguda, e, para tal, ocorreu a administração do sesquiterpeno nas doses de 100, 500, 700, 1000 e 2000 mg/kg por via oral, sendo observado o número de mortes por um período de 14 dias. Essa etapa é fundamental para o uso seguro de uma substância, visto que fornece informações das doses capazes de provocar efeitos tóxicos em um estudo pré-clínico (EATON; KLAASSEN, 1996; SÁ; ALMEIDA, 2006).
Na avaliação da toxicidade aguda, não ocorreram mortes até a dose de 2000 mg/kg nem sinais de toxicidade no período de 14 dias de observação, sugerindo que o nerolidol apresenta baixa toxicidade, quando administrado agudamente. A via de administração do sesquiterpeno pode ter influenciado em sua baixa toxicidade, pois a biodisponibilidade pode apresentar-se diferente, quando administrado na via intraperitoneal, devido a vários fatores como inativação enzimática, influência dos sucos digestivos ou diminuição no esvaziamento gástrico (ABDEL-BARRY; AL-HAKIEM, 2000, PIRES et al., 2004).
Apesar da impossibilidade de calcular a dose única responsável por provocar a morte em 50% dos animais (DL50) tratados com o nerolidol, já que
essa se encontra superior a 2000 mg/kg, isso não indica que o mesmo não apresenta toxicidade, uma vez que qualquer substância química pode ser tóxica, se a dose ou a exposição se tornar suficientemente alta, de modo que as alterações observadas forem atribuídas às altas doses utilizadas (SIPES; DART, 1997; DINIZ, 2000; VASCONCELOS et al., 2007).
Segundo Pículo (2010), o nerolidol provoca uma clastogenicidade e fraca genotoxicidade em células de camundongo, quando administrado em altas doses, devendo-se tomar cuidado ao usá-lo como futuro agente terapêutico ou aromatizante de alimentos. Em baixas concentrações, o nerolidol pode interferir negativamente no funcionamento mitocondrial hepático, causando uma citotoxicidade em células da linhagem de carcinoma hepatocelular humano (HepG2)(FERREIRA et al., 2012). Embora não haja estudos sobre a neurotoxicidade do nerolidol, sabe-se que o farnesol, sesquiterpeno com estrutura semelhante ao nerolidol, não apresenta efeitos neurotóxicos significantes em cérebros de camundongos (OLIVEIRA JUNIOR et al., 2012).
Seguindo os parâmetros comportamentais propostos por Almeida e Oliveira (2006) para investigação da atividade farmacológica de novas moléculas no sistema nervoso central e periférico, realizou-se uma triagem psicofarmacológica. Nesse experimento, os grupos de camundongos tratados com nerolidol nas doses de 300, 500, 700, 1000 e 2000 mg/kg apresentaram alterações comportamentais sugestivas de drogas depressoras do SNC, tais como a diminuição da ambulação e da resposta ao toque diminuído e a perda do reflexo corneal e auricular.
Outro parâmetro observado, a analgesia, foi avaliado por meio do aumento da latência na resposta do animal ao sofrer uma pressão no terço inferior da cauda (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006). Esse efeito foi observado de maneira intensa em todas as doses analisadas, indicando que testes para avaliar a atividade antinociceptiva do nerolidol forneceriam resultados promissores.
O teste do Rota-Rod, descrito por Dunham & Miya (1957), consiste em avaliar a capacidade do camundongo em equilibrar-se sobre uma barra que gira a uma velocidade constante (CARLINI; BURGOS, 1979). Nessa metodologia, é possível identificar alterações na coordenação motora do animal, as quais podem estar associadas a um efeito relaxante muscular causado por drogas. Esse teste é amplamente aceito como triagem, para detectar alterações neurológicas (efeitos adversos) associadas a modificações cerebelares produzidas por drogas como os antiepiléticos e antipsicóticos
(LOSCHER; FASSBENDER; NOLTING, 1991; ABREU; BOLOGNESI; ROCHA, 2000; LUSZCZKI et al., 2005; CHANG-UM et al., 2010).
A avaliação da função motora, após um tratamento, é importante, para não gerar resultados falso-positivos nos modelos animais de nocicepção, uma vez que distúrbios na atividade locomotora do animal podem levar a conclusões errôneas, tais como efeito “pseudo-antinociceptivo” (YOKORO et al., 2001; RABOISSON; DALLEL, 2004; WILHELM et al., 2009).
Todas as doses testadas do nerolidol no teste do Rota-Rod não afetaram a coordenação motora dos animais tratados, descartando algum efeito miorelaxante ou neurotóxico, já que não apresentou alteração significante entre o grupo controle e experimental.
A atividade antinociceptiva do nerolidol foi avaliada por modelos de nocicepção químico (teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético e teste da formalina) e térmico (teste da placa quente). Além disso, investigaram-se alguns possíveis mecanismos envolvidos no efeito antinociceptivo do nerolidol.
O teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético é bastante utilizado na triagem de substâncias com potencial efeito antinociceptivo (COLLIER et al., 1968). Esse método apresenta boa sensibilidade, porém baixa especificidade, isto é, drogas com diferentes mecanismos de ação podem obter êxito nesse teste. Segundo Stepanovic- Petrovic et al (2008), anticonvulsivantes como oxcarbazepina, gabapentina e topiramato são efetivos no modelo de contorção, sem provocar debilidade motora. O efeito nociceptivo também pode ser prevenido por anti-inflamatórios esteroidais e não-esteroidais, como também por analgésicos de ação central (MANJAVACHI et al., 2009; SANTOS et al., 2010).
A administração intraperitoneal do ácido acético provoca uma irritação no peritônio seguida por uma contorção, caracterizada pela contração abdominal e pelo alongamento das patas traseiras (COLLIER et al., 1968). Esse comportamento nociceptivo é resultado da ativação direta dos canais de cálcio não seletivo presentes nas fibras nociceptiva aferentes ou através da estimulação de vários mediadores inflamatórios, tais como produtos da biossíntese da prostaglandina, aminas simpatomiméticas, bradicinina, substância P, e citocinas (TNF-α, IL-1 , IL-8) liberadas no líquido peritoneal por
macrófagos e mastercells residentes (DUARTE et al., 1988; RIBEIRO et al., 2000).
O nerolidol foi capaz de reduzir o número de contorções abdominais induzidas por ácido acético nas três doses testadas (200, 300 e 400 mg/kg, p.o.) de forma similar aos grupos padrões. Esse resultado indica que o nerolidol tanto pode apresentar um efeito antinociceptivo central quanto impedir a liberação de mediadores inflamatórios.
A fim de melhor esclarecer a atividade antinociceptiva do nerolidol, realizou-se o teste da formalina como forma de diferenciar se o efeito apresentado foi central ou periférico, uma vez que essa metodologia possui duas fases distintas (HUNSKAAR; HOLE, 1987). A primeira fase (0-5 min) consiste na estimulação química direta dos nociceptores, levando a ativação das fibras C e liberação de substância P (SHIBATA et al., 1989). Já a segunda fase (15-30 min) é caracterizada por um processo inflamatório no tecido periférico, acarretando liberação de serotonina, bradicinina e histamina, como também aumenta o nível dos mediadores excitatórios na medula espinhal, entre eles, glutamato e NO (HUNSKAAR; HOLE, 1987; TJOLSEN et al., 1992; LOPES et al., 2010). Nessa última fase, também ocorre um sinergismo entre a histamina e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) na percepção da dor (MOBARAKEH et al., 2011). O neuropeptídio, taquicinina, possui um importante papel a nível supraespinhal na modulação da dor provocada pela formalina, podendo o uso de antagonistas inibir ambas as fases do teste (SANTOS; CALIXTO, 1997).
Metabólitos como o etilpiruvato, formado a partir da reação catalítica do piruvato, é capaz de inibir a nocicepção inflamatória induzida pela formalina, pois inibe a fosforilação da ERK no corno dorsal espinhal (KAO; FINK, 2010; LEE et al., 2012). Segundo MCNAMARA (2007), a formalina age diretamente excitando os neurônios sensoriais e provoca a abertura dos TRPA1, que é um canal catiônico importante na dor inflamatória.
O nerolidol foi capaz de inibir o comportamento de lambida da pata nas duas fases do teste da formalina, mostrando que pode atuar tanto na dor neurogênica quanto em processos inflamatórios. Tais resultados se assemelham ao narcótico central utilizado como padrão (morfina). A
dexametasona, anti-inflamatório esteroidal, reduziu o tempo de lambida na segunda fase, sem alterar a primeira fase do teste.
A atividade antinociceptiva dos terpenoides pode estar associada à diminuição da excitabilidade neural. O sesquiterpeno, (-)-α-bisabolol, é capaz de causar um bloqueio irreversível dos canais de Na+ dependente de voltagem
expressos nas fibras aferentes sensoriais, que são fundamentais na percepção da dor (CUMMINSK; SHEETS; WAXMAN, 2007; ALVES et al., 2010; LIU; WOOD, 2011). É possível, portanto, que o nerolidol esteja desempenhando seu efeito analgésico por esse mecanismo.
O teste da placa quente avalia substâncias com possível ação analgésica central. A placa aquecida à temperatura constante provoca respostas comportamentais, como lambida da pata ou movimento de pular (NEMIROVSKY et al., 2001; ORLANDI et al., 2011). O estímulo térmico promove ativação dos nociceptores (Aδ e C) que levam o impulso para o corno dorsal da medula espinhal e aos centros corticais em que são interpretados (DICKENSON; BESSON, 1997).
Apesar de o nerolidol apresentar um potente efeito antinociceptivo no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético e na primeira fase do teste da formalina, não mostrou atividade no teste da placa quente em nenhuma das doses testadas. Esse resultado indica a não-participação do estímulo térmico na antinocicepção central mediada pelo nerolidol. O óleo essencial de Peperomia serpens possui o nerolidol como um dos principais constituintes e também não foi efetivo no teste da placa quente, sugerindo que o sesquiterpeno contribui para atividade antinociceptiva do óleo, mas não é responsável pela resposta ao estímulo térmico (PINHEIRO et al., 2011).
Na tentativa de desvendar se o mecanismo antinociceptivo do nerolidol estaria envolvido nas vias inibitórias da dor, utilizaram-se antagonistas farmacológicos capazes de impedir a ligação entre o agonista e um receptor específico. Dessa forma, se a via de sinalização responsável pela antinocicepção causada pela substância-teste for bloqueada, o seu efeito será revertido. O teste da formalina, anteriormente descrito, foi o método adotado para elucidar os possíveis mecanismos pelos quais o nerolidol exerce sua atividade.
Os receptores opioides (mu, kappa e delta) estão localizados em vários passos do mecanismo de transmissão do estímulo doloroso e influenciam direta ou indiretamente na atividade antinociceptiva dos seus agnoistas, participando da percepção e modulação da dor em sítios localizados a nível espinhal e supraespinhal (WARD; TAKEMORI, 1983; ROGERS et al., 1992; BRUEHL et al., 2009). Todos os receptores opioides pertencem à família dos receptores acoplados à proteína Gi/Go, promovem a abertura de um tipo
específico de canais de potássio e inibem a abertura dos canais de cálcio controlados por voltagem, levando à redução na excitabilidade neuronal (SAWYNOK, 2003).
A morfina é o analgésico opioide modelo e, por mais de duas décadas, é considerada droga de primeira escolha para tratamento de vários tipos de dor, no entanto possui sérios efeitos colaterais como tolerância, depressão respiratória e dependência física e psicológica (MCQUAY, 1999; YAMANAKA, 2012). Diante disso, a indústria farmacêutica se empenha na descoberta de novas drogas com atividade terapêutica semelhante à morfina, mas com efeitos colaterais diminuídos (HESS et al., 2010).
Em nosso experimento, a naloxona, antagonista não seletivo opioide, foi capaz de inibir o efeito da morfina, porém não reverteu o efeito antinociceptivo induzido pelo nerolidol, indicando a não-participação do sistema opioide no efeito. Esta conclusão ocorreu pelo fato de que o pré-tratamento dos animais com naloxona não alterou o tempo de lambida da pata em nenhuma das fases do teste da formalina e inibiu completamente o efeito antinociceptivo causado pela morfina.
Com o objetivo de investigar a participação dos canais de K+
ATP na
antinocicepção causada pelo nerolidol, utilizou-se uma sulfonilureia, a glibenclamida, bastante usada na prática clínica em pacientes diabéticos (OCAÑA et al., 2004).
Os canais de K+neurais estão divididos em quatro classes, de acordo com as suas estruturas e agonistas específicos, sendo conhecidos como canais de K+ dependente de voltagem (Kv), ativados por cálcio (KCa), retificador
de entrada (Kir) e de dois poros (K2P) (GUTMAN et al, 2003). É sabido que os
pertencem à família Kir e estão envolvidos na percepção da dor (OCAÑAet al.,
2004; HAJHASHEMI; AMIN, 2011).
A administração central de agonistas para os canais de K+, tais como diazoxide, minoxidil e cromacalina, produz uma antinocicepção e é capaz de potencializar o efeito analgésico de agonistas opioides e α2-adrenérgicos
(GALEOTTI et al., 1999, WELCH; DUNLOW, 1993).
Os resultados mostraram que a glibenclamida não atenua a dor nem na primeira nem na segunda fase do teste da formalina, como mostrado em estudos anteriores (WELCH; DUNLOW, 1993; HAJHASHEMI; AMIN, 2011). O pré-tratamento com a sulfonilureia também não foi capaz de inibir o efeito antinociceptivo do nerolidol em nenhuma das fases do teste da formalina, indicando a não-participação dessa via.
Os sesquiterpenos, zerumbone e polygodial, exercem suas atividades antinociceptivas com a participação dos canais de K+ATP e dos receptores
opioides (MENDES et al., 2000; SULAIMAN et al., 2009; PERIMAL et al., 2011). Tais resultados diferem dos encontrados com o nerolidol, porém, apesar de possuírem a mesma quantidade de átomos de carbono, suas estruturas químicas não são iguais, o que explicaria os diferentes mecanismos de ação.
Muitos estudos mostram o envolvimento dos receptores GABA na modulação da dor, essencialmente através do sistema inibitório descendente (MATSUMOTO, 1989; MACDONALD; OLSEN, 1994; TATSUO et al., 1997). Em condições saudáveis, os interneurônios GABAérgios e glicinérgicos servem como “portas”, controlando a transmissão do sinal nociceptivo da periferia até o sistema nervoso central (ZEILHOFER; MOHLER; DI LIO, 2009). Estudos recentes sugerem que um déficit na inibição mediada pelo neurotransmissor GABA na medula espinhal está relacionado com o surgimento da dor de diversas origens (ZEILHOFER, 2008; ZEILHOFER; MOHLER; DI LIO, 2009).
Embora haja progresso no desenvolvimento de novos fármacos, a utilização sistêmica de agonistas GABAérgicos é limitada por efeitos colaterais em outros sistemas que não estão envolvidos na dor (JASMIN; WU;OHARA, 2004; ENNA; MCCARSON, 2006).
A literatura descreve vários constituintes de óleos essenciais que possuem atuação no sistema gabaérgico (COSTA et al., 2011; HELDWEIN et al., 2012). Com base nessas infromações, avaliou-se a participação dos
receptores GABAA na antinocicepção mediada pelo nerolidol, através da
utilização de um antagonista para esses receptores.
O nerolidol foi capaz de diminuir o tempo de lambida da pata nas duas fases do teste da formalina, entretanto esse efeito foi inibido ao administrar a bicuculina. Esse resultado indica que o efeito antinociceptivo do nerolidol é mediado pelos receptores GABAA. A via gabaérgica, uma vez bloqueada pela
bicuculina, pode provocar neuropatias, devido à perda da inibição mediada pelo receptor GABA no mecanismo nociceptivo (GREEN; DICKENSON, 1997; MALAN; MATA; PORRECA, 2002; BASBAUM; BAUTISTA; SCHERRER, 2009).
Os receptores GABAA são heteropentaméricos e formados por duas
subunidades α (α1, α2, α3 ou α5), duas subunidades e uma subunidade β
(RUDOLPH; UMÖHLER, 2004). As ações sedativas dos benzodiazepínicos são atribuídas aos receptores GABAA,contendo a subunidade α1. A ação ansiolítica
e miorelaxante acontece em receptores GABAA que contem a subunidade α2
(RUDOLPH et al., 1999 ;MCKERNAN et al., 2000; LÜSCHER et al., 2012). O derivado piridoindole, SL65148, liga-se nos receptores GABAA, contendo as
subunidade α2e/ou α3, e provoca um efeito anti-hiperalgésico comprovado pela
redução no tempo de lambida nas duas fases do teste da formalina, sem provocar sedação ou debilidade motora (GRIEBEL et al., 2001; KNABL et al., 2009).
A dor está intimamente relacionada à inflamação, pois os mediadores inflamatórios liberados na injúria tecidual são capazes de modificar a transmissão e a excitabilidade dos nociceptores (SCHOLZ; WOOLF, 2002). Nesse contexto, o modelo de edema de pata induzida por carragenina foi escolhido para avaliar a atividade anti-inflamatória do nerolidol, já que é o modelo experimental mais usado e apresenta sensibilidade e reprodutibilidade (BARBOSA-FILHO et al., 2006; SOUTO et al., 2011).
A carragenina, quando administrada na região subplantar da pata do animal, provoca uma inflamação aguda que envolve diversas fases (VINEGAR; SCHREIBER; HUGO, 1969). A primeira fase acontece uma hora após a administração do agente flogístico, em razão da produção de radicais livres e da liberação dos mediadores pró-inflamatórios que estimulam a liberação de serotonina, histamina, leucotrienos e óxido nítrico (BURCH; DEHAAS, 1990;
WIRTH et al., 1992). Na segunda fase (1-6h), há produção mais efetiva de TNF-α, IL-1 e COX-2, os quais contribuem para o aumento da permeabilidade vascular, reforçando a formação do edema (SALVEMINI et al., 1996). Os anti- inflamatórios não-esteroidais reduzem preferencialmente a fase tarde, em virtude da inibição da isoforma COX-2, que é responsável pela geração de prostanoides pró-inflamatórios (VANE; BOTTING, 1998).
Nossos resultados demostram que o nerolidol reduziu a formação do edema de pata induzido por carragenina durante as cinco horas de observação, sugerindo uma inibição da COX-2 ou a redução dos mediadores supracitados responsáveis pela quimiotaxia de células para o sítio inflamado.
A pomada tópica de dois sesquiterpenos isolados, lychnopholide e eremantholide C, do extrato etanólico das partes aéreas de Lychnophora trichocarpha, conhecida como “Arnica Brasileira”, apresentou uma redução no edema de pata induzido por carragenina relacionada à inibição tanto da produção de NO quanto do mediador inflamatório TNF-α (FERRARI et al., 2012). Esse estudo exemplifica a capacidade anti-inflamatória dos sesquiterpenos, já confirmada na literatura científica por vários estudos (RÜNGELER et al., 1998; HERNÁNDEZ et al., 2001; BERMEJO et al., 2002; SULAIMAN et al., 2010; YOUN et al., 2012).
Baseada na capacidade antiedematogênica do nerolidol, comprovada após a administração da carragenina, surgiu a hipótese que essa atividade poderia estar relacionada com a inibição da migração celular. Com o propósito de avaliar essa correlação, realizou-se o teste da peritonite induzida por carragenina.
Uma das características da inflamação aguda é a migração de células no local da lesão. A administração intraperitoneal da carragenina provoca um infiltrado de neutrófilos vindos da vênula mesentérica para cavidade peritoneal. Esse evento ocorre em consequência da vasodilatação e do aumento da permeabilidade vascular e da liberação de vários mediadores inflamatórios, tais como TNF-α, IL-1 , IL-8 e prostanoides (HALL et al., 1998).
O tratamento com nerolidol reduziu o número de leucócitos no líquido peritoneal, principalmente, das células polimorfonucleares, sugerindo que o nerolidol desempenha um papel importante no controle da inflamação. Pinheiro et al. (2011) relatou que o óleo essencial de Peperomia serpens, que
apresenta o (E)-nerolidol como constituinte majoritário, pode inibir as moléculas de adesão responsáveis pela ligação e pela migração celular.
O fator de necrose tumoral (TNF-α) faz parte do grupo de citocinas pró- inflamatórias envolvidas na iniciação e na amplificação dos processos inflamatórios, favorecendo a expressão das moléculas de adesão no endotélio e a quimiotaxia de neutrófilos (EIGLER et al., 1997). O TNF-α é a principal citocina a ser formada após o dano tecidual ou a infecção, induzindo a resposta imune inata pela ativação de células T e de macrófagos (BEUTLER; CERAMI, 1989). O TNF-α também é responsável pela liberação adicional de cininas e leucotrienos, os quais desempenham papel importante no prolongamento da resposta inflamatória (TONUSSI; FERREIRA, 1999).
Ao dosar a concentração de TNF-α no líquido peritoneal dos animais tratados com nerolidol no modelo da peritonite induzida por carragenina, observamos que a citocina estava diminuída. Esse resultado apoia a redução do edema de pata e da contagem de leucócitos, desvendando, pelo menos em parte, o mecanismo pelo qual o nerolidol desempenha sua atividade anti- inflamatória. Esse resultado é bastante semelhante ao encontrado na literatura com o sesquiterpeno alpha-bisabolol que sugere que a redução dos níveis de TNF-α pode está relacionado à inibição dos fatores nucleares de transcrição como fator nuclear kappa B (NF-ƙB) e fator de ativação da proteína 1 (AP-1) que regulam muitos genes para manutenção da inflamação (KIM et al., 2011; ROCHA et al., 2011).
Em suma, esses resultados demonstram a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do nerolidol em modelos experimentais, contribuindo para o conhecimento científico dos sesquiterpenos. Além disso, podem ajudar a esclarecer os mecanismos farmacológicos de óleos essenciais que possuem o nerolidol como constituinte majoritário. Mais estudos pré-clínicos são necessários para melhor caracterização do efeito descoberto, na expectativa da realização de ensaios clínicos que comprovem o potencial analgésico e anti- inflamatória desse fármaco.