Migration: Does It Pose a Threat to the EU?

A sensibilidade bacteriana é determinada em laboratório pela ausência de crescimento dum microrganismo após 24h de exposição a uma concentração pré- determinada de antibiótico. São usadas quantidades crescentes de antibiótico para identificar a concentração mínima capaz de impedir a proliferação duma concentração estandardizada de bactérias, 105 unidades formadoras de colónias (UFC)/mL, ou seja a CIM (figura 11). Esta CIM é comparada com os limiares, estabelecidos por laboratórios de referência, o que permite classificar cada bactéria isolada em resistente, intermédia ou sensível a cada antibiótico. Na Europa esta regulação é feita pela European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing – EUCAST, que indica igualmente as cartas antibióticas a serem utilizadas em cada laboratório para testar a sensibilidade bacteriana. A mesma CIM pode ser determinada por outros métodos, quer automatizados quer através de gradientes de concentração em placa.

Figura 11 – Esquema da determinação da concentração inibitória mínima (CIM). A menor concentração capaz de impedir o crescimento bacteriano durante 24h.

No entanto, a expressão fenotípica das bactérias in vivo pode ter características diferentes das observadas em laboratório, o que pode ter implicações na sua sensibilidade aos antibióticos, dificultando ou mesmo impossibilitando a erradicação destes agentes.

Um dos mecanismos responsáveis pela diminuição da resposta à terapêutica é o efeito de inóculo, ou seja a diminuição da sensibilidade bacteriana aos antibióticos que se verifica na presença de cargas microbiológicas elevadas. De facto, quando o inóculo bacteriano é de grande dimensão, cada bactéria pode apresentar fenotipo (e

CIM) diferente. Esta variação da sensibilidade foi demonstrada por Thomson e col.5

num modelo de Klebsiella pneumoniae produtora de extended spectrum beta lactamases (ESBL). Nesse estudo, foi identificada diminuição substancial da

sensibilidade aos antibióticos quando a dimensão do inóculo passava de 105 UFC/mL

para 107 UFC/mL.

Esta resistência pode ter tradução na prática clínica, uma vez que a carga bacteriana nas infeções graves é muito mais elevada do que a testada por rotina no laboratório. No estudo referido, esta diferença foi particularmente evidente para as cefalosporinas de 3ª geração, que podem apresentar eficácia in vitro mas que são virtualmente ineficazes contra estes microrganismos in vivo.

Esta variação da CIM associada à própria carga bacteriana foi igualmente demonstrada in vitro com o Staphylococcus aureus sensível à meticilina. Foi calculada a CIM desse agente para 6 antibióticos diferentes (daptomicina, vancomicina, ciprofloxacina, oxacilina, gentamicina e linezolide), usando dois inóculos diferentes. Ficou demonstrado que a CIM aumentava com a quantidade de bactérias presentes no meio. Um modelo matemático permitiu atribuir esta variação à proporção entre a quantidade de moléculas do antibiótico e a quantidade de células bacterianas6.

Numa coorte de doentes com pneumonia pneumocócica7, os autores identificaram

uma associação entre a dimensão do inóculo de Streptococcus pneumoniae, inferida por determinação quantitativa de real-time polymerase chain reaction no sangue, e a gravidade clínica, em particular a presença de choque séptico, a necessidade de ventilação mecânica e a mortalidade, as quais aumentaram diretamente com o número

de cópias dessa bactéria, eventualmente traduzindo menor resposta aos antimicrobianos.

4. Biofilmes

A necessidade de instrumentação invasiva, quer com fins diagnósticos quer com finalidade terapêutica, implica muitas vezes a colocação de material estranho no doente crítico, com consequente quebra das suas barreiras naturais de proteção, em particular a cutânea. As bactérias podem aderir às superfícies do material exógeno através de estruturas de membrana, adesinas, que lhes permitem fixar-se neste material8.

Nas condições adequadas de metabolismo e nutrição, estes diferentes clones bacterianos podem multiplicar-se e crescer. Foi demonstrado que as bactérias são capazes de segregar para o meio proteínas de “comunicação”, quer inespecíficas (comunicação interbacteriana universal) quer específicas, de espécie. Cada bactéria é capaz de reconhecer na sua superfície a densidade destas proteínas de sinalização e perceber a carga bacteriana do meio. Através deste mecanismo, de quorum sensing, reconhecimento do número, inicialmente descrito em bactérias Gram negativo mas também existente em microrganismos Gram positivo, as bactérias têm a capacidade de conhecerem a sua densidade populacional, de espécie9. Quando essa densidade populacional ultrapassa um determinado limiar, são desencadeadas, de forma conjugada, mudanças fenotípicas na espécie bacteriana, com expressão de glicoproteínas, que lhes permitem formar matrizes. Estas constituem a base para os biofilmes, agregado de micro-organismos que crescem aderentes a uma superfície e revestidos desta camada heterogénea de compostos extracelulares. A criação destas estruturas consome recursos e energia às bactérias, ficando assim reservada para a ocasião favorável, quando o número (quorum) de bactérias é suficientemente elevado10 para ultrapassar as defesas do organismo. Este comportamento tem já muitas similaridades com o que ocorre durante o desenvolvimento de organismos multicelulares.

Estes mecanismos de “comunicação” bacteriana permitem a rápida adaptação a alterações do próprio microambiente bacteriano, inclusive das resultantes da exposição aos antibióticos. De facto, estas estruturas multicelulares têm capacidade para nutrir e proteger as bactérias, tornando-as potencialmente mais virulentas11,12, facilitando a sua proliferação e o desenvolvimento de mutantes resistentes, particularmente quando os biofilmes são expostos a concentrações sub-terapêuticas de antibióticos13.

Diversos factores contribuem para aumentar a resistência das bactérias residentes nos biofilmes à ação dos antibióticos, os quais não existem nas formas plantónicas bacterianas, livres:

1. Neutralização dos antibióticos pela matriz polissacárida 2. β-lactamases extracelulares

3. Inativação de compostos antibióticos por ativação conjugada de genes responsáveis por resistência

4. Transferência mediada por plasmídeos de genes de resistência

5. Subpopulações bacterianas em estado latente, de baixo metabolismo (persistentes), que podem mesmo não expressar o local de ligação do antibiótico14.

Igualmente a própria matriz do biofilme pode facilitar a expressão, desrepressão ou amplificação de diferentes genes de resistência, mesmo quando as bactérias são expostas a concentrações elevadas de antibióticos15. Em consequência, num biofilme o perfil de sensibilidade bacteriano é diferente do estudado in vitro. As bactérias existentes nestas estruturas, as quais colonizam com frequência o material exógeno, tais como as algálias, cateteres venosos (figura 12), próteses ortopédicas, válvulas artificiais cardíacas, podem ser virtualmente intratáveis.

Figura 12 – Colonização dum cateter venoso central (CVC) pelas bactérias existentes na pele. As mesmas fixam-se ao material exógeno e desenvolvem biofilmes, impossíveis de erradicar pelos antibióticos.

Têm sido testados inibidores da formação dos biofilmes, os quais poderiam minimizar a prevalência e virulência destas infeções. A azitromicina tem a capacidade de interferir com o sistema de quorum sensing da Pseudomonas aeruginosa, propriedade que poderia facilitar a prevenção da pneumonia associada ao ventilador causada por este agente. Van Delden e col. estudaram doentes submetidos a ventilação mecânica invasiva colonizados por Pseudomonas aeruginosa produtora de rhamanolipid (substância que aumenta a virulência e a patogenecidade deste agente). Os doentes randomizados para receberem azitromicina (300mg/dia IV, n=43) tiveram menos episódios de pneumonia (4.7%) que os doentes medicados com placebo (n=42, 14.3%). Esta diferença não foi significativa (p=0.156)16.

A proliferação bacteriana e o desenvolvimento das infeções resulta assim da capacidade das bactérias se adaptarem no organismo e proliferarem. Tal depende também da relação que as mesmas estabelecem com o hospedeiro e o seu sistema imunitário.

Um estudo recente, prospectivo, estudou a expressão genética duma coorte de doentes críticos sob ventilação mecânica invasiva. Nessa população foram segregados os doentes que desenvolveram infeção adquirida no hospital, quer pneumonia quer traqueobronquite. Foram comparadas as expressões genéticas destes dois grupos de

doentes, tendo em atenção que a pneumonia é uma infeção mais grave, a qual traduz maior inflamação e maior atingimento parenquimatoso. Foram encontradas diferenças significativas entre os dois grupos particularmente na expressão fenotípica das áreas responsáveis pela síntese de proteínas do sistema imune, nomeadamente das vias do complemento. Essas diferenças já existiam previamente ao próprio desenvolvimento da infeção17, traduzindo a influência do hospedeiro na expressão clínica da infeção.