Calvatia gigantea é um fungo superior (basidiomiceto) comestível, conhecido
como “puffball” ou “bufa de lobo”. Degrada substratos ricos em taninos, excretando grandes quantidades de α amilase quando cultivados em subprodutos agrícolas com altos teores destes compostos (KEKOS & MACRIS, 1983). CHRISTAKOPOULOS et
al. (1992) pesquisaram a produção de lipase extracelular por este fungo,
empregando como meio básico o meio de cultura mineral com a composição seguinte (g/L): NaH2PO4 (12,0); KH2PO4 (2,0); MgSO4.7H20 (0,3); CaCl2.2H2O (0,3). Os autores estudaram o efeito da adição de fontes de carbono (2%; p/v) como alguns carboidratos (frutose, glicose, lactose e sacarose) e lipídios (óleo de milho, de oliva, de soja e de girassol, previamente emulsionados em solução de goma arábica), o efeito do tipo de fonte de nitrogênio (sais de amônio: cloreto, fosfato e sulfato; caseína; água de maceração de milho; peptona; uréia; e extrato de levedura), o efeito do pH inicial do meio de cultura e a temperatura de incubação. Foi demonstrado que ocorreu maior produção de lipase com a glicose e com o óleo de girassol, tendo este último propiciado maior rendimento. Isso confirma dados da literatura de que os lipídios são melhores fontes de carbono do que carboidratos para a produção de lipases. Também foi demonstrado que o fosfato de amônio foi superior à peptona como fonte nitrogenada. Empregando um meio de composição otimizada quanto às fontes de carbono e de nitrogênio, foi verificado que o pH 6,0 e incubação a 25 oC, completaram as condições para se obter maior produção de lipase.
A produção de lipase pelo fungo termofílico Humicola lanuginosa foi pesquisada por OMAR et al. (1987) em cultivo submerso em fermentador de dez litros de capacidade, com agitação e aeração de 200 rpm e 1,0 vvm, respectivamente, empregando inóculo de 4% (v/v) e incubação a 45 oC. Os autores empregaram como meio basal no pH 7,0 (em %; p/v): extrato de levedura (1,0); NaCl (0,5); CaCl2.2H2O (0,01); óleo de oliva (1,0). Foram estudados o efeito da adição de fontes de carbono, em substituição do óleo de oliva, na forma de treze diferentes carboidratos (1%; p/v), tendo o sorbitol despontado como a melhor alternativa. Com formulação contendo sorbitol foram testados vários compostos nitrogenados como água de maceração de milho, peptona, sais de amônio e extrato de levedura a 1,0% (p/v). As fontes de nitrogênio foram adicionadas após 48 h de cultivo, tendo o primeiro composto apresentado a maior produção (63 U/mL). A produção de lipase que praticamente ficou estagnada na ausência de material lipídico (menos de 10 U/mL), aumentou significativamente com Tween 80, óleo de castor e óleo de baleia.
13 Isolamento e seleção de fungos filamentosos produtores de lipase
Nos anos recentes, o desenvolvimento mais importante no campo da síntese química tem sido a aplicação de sistemas biológicos em reações químicas, sendo o
Japão o país que mais domina este campo de pesquisa aplicada. As reações catalisadas por enzimas ou sistemas enzimáticos apresentam maior especificidade do que as formas convencionais de reações orgânicas. Conseqüentemente, o uso industrial de enzimas tem desenvolvido rapidamente. Por isso, a procura constante de enzimas que sejam capazes de catalisar novas reações é importante. Provavelmente, o meio mais eficiente para encontrar novas enzimas seja o isolamento e seleção de microorganismos como conseqüência das suas características de diversidade e versatilidade (SHIMIZU et al., 1997; OGAWA & SHIMIZU, 1999; 2002).
Os microorganismos, possuindo os atributos fundamentais para que possam ser usados em processos biotecnológicos, podem ser isolados, purificados, selecionados e testados como culturas puras, a partir de uma fonte natural (NAKAYAMA, 1981). Essas fontes podem ser o solo (terra); água; vegetais frescos e fermentados; plantas e animais vivos; águas residuais; alimentos frescos e deteriorados: No caso das lipases os fungos produtores podem ser isolados de resíduos industriais gordurosos, de fábricas de processamento de óleos vegetais e laticínios, de solos contaminados com óleo e de sementes oleaginosas (SZTAJER et
al., 1988; SHARMA et al., 2001). As culturas puras podem ser obtidas por meio das
técnicas de isolamento direto ou com enriquecimento seletivo (NAKAYAMA, 1981). Em seguida, estas culturas são submetidas às condições altamente seletivas para permitir a detecção e seleção daqueles microorganismos ou metabólitos de interesse, primeiramente em meio de cultura sólido em placa de Petri (seleção primária), em que os microorganismos que possuam a capacidade de produzir o metabólito ou substância de interesse são detectados. Na etapa seguinte as culturas selecionadas, em geral, são cultivadas em cultivo submerso, sob diversas condições, obtendo-se, assim, diversos tipos de caldos fermentados resultantes do crescimento do mesmo microorganismo. A quantidade produzida dos metabólitos ou das substâncias em cada cultivo é comparada, tendo-se uma avaliação do rendimento de produção em diferentes situações, podendo-se, assim, selecionar as cepas mais promissoras, descartando-se as demais (NAKAYAMA, 1981).
O isolamento primário de fungos a partir de materiais naturais contaminados com uma flora microbiana mista de bactérias e actinomicetos, além dos fungos, requer o emprego de condições de enriquecimento seletivo. Neste caso, isso pode ser feito empregando-se meios de cultura com pH ácido e ou adicionados de substâncias inibidoras de crescimento tais como antibióticos, corantes e outras
substâncias de ação específica. No caso dos fungos filamentosos ocorre, ainda, a necessidade de se evitar o crescimento rápido e espalhado de alguns fungos saprófitas. Estes problemas foram primeiramente estudados por LITTMAN (1947) o que resultou no desenvolvimento de um meio de cultura considerado adequado que continha 1,5 % (p/V) de bile bruta (“Oxgall”), 1,0 mg% de cristal violeta e 30 U/100 mL de estreptomicina. Este meio tem sido, desde então, empregado para isolamento de fungos patogênicos para o ser humano a partir de amostras biológicas.
A seleção primária para detecção de uma atividade particular tem peso significativo no processo de seleção de microrganismos específicos. Os ensaios a serem empregados nesta fase devem levar em conta aspectos tais como simplicidade, custo, rapidez e especificidade. Segundo STEELE & STOWERS (1991) esta é, geralmente, a etapa que determinará o sucesso ou fracasso de um programa de seleção. A maioria dos métodos é categorizada como diretos quando permite a identificação específica do produto alvo. Como indiretos quando ocorre a indicação da presença de determinada substância pela detecção de alguma atividade específica, tal como a detecção de uma atividade enzimática via reação colorimétrica ou fluorimétrica. Em geral a seleção primária é realizada pelo cultivo do microrganismo que está sendo testado em meio de cultura solidificado com ágar grau bacteriológico, em placas de Petri. Segundo os mesmos autores, no caso das lipases, a detecção da atividade enzimática apresenta algumas peculiaridades que dificultam a seleção em placa de Petri tais como ausência de especificidade de algumas delas e problemas na distinção entre lipases verdadeiras e as esterases, quando não é usado o substrato adequado.