Os esquemas das construções plasmidiais estão apresentados na Figura 2, com a indicação das principais características de cada um dos vetores utilizados conforme descrito a seguir. Para gerar as figuras ilustrativas das construções plasmidiais, utilizamos o programa Simvector.
3.7.1. Construção do pCR-DdI-2
Para clonagem do cDNA de DdI-2 (786pb), foram confeccionados oligonucleotídeos específicos (DdI01 e DdI02) para amplificação da região codificadora da seqüência do ATG ao TAA. Os oligonucleotídeos foram planejados de forma a permitir a posterior subclonagem do cDNA de DdI-2 nos vetores pGADT7 (ensaio de duplo-híbrido) e pAE (expressão de DdI-2 recombinante em bactérias). Como molde utilizamos cDNA total obtido a partir da transcrição reversa de 5µg de RNA total da fase vegetativa de D. discoideum como descrito no item 3.4.2. O fragmento de cDNA amplificado foi ligado no vetor pCR2.1, que faz parte do TA
cloning kit (Invitrogen) gerando a construção pCR-DdI-2 (Figura 2A). O vetor pCR2.1
possui o promotor T7 e apresenta oriC como origem de replicação em bactérias. As células transformadas com este vetor podem ser selecionadas com o antibiótico ampicilina.
3.7.2. Construção do pCR-DdI-2_ko
Para construção do plasmídeo pCR-DdI-2_ko, o cDNA do DdI-2 foi interrompido com a inserção de um cassete de expressão para resistência ao antibiótico
blasticidina. Essa marca de resistência possibilita selecionar clones de D.
discoideum resistentes a esse antibiótico, ou seja, que tenham a cópia do cDNA
alterada integrada no genoma após transfecção. Para obtenção da construção pCR_DdI-2KO (Figura 2B), o cDNA do DdI-2 clonado no vetor pCR2.1 (Figura 2A) foi digerido com a enzima MunI, linearizando a construção. O sítio para esta enzima está localizado a ~56pb do ATG inicial do cDNA. A construção digerida foi incubada com a T4 DNA polimerase e nucleotídeos para gerar extremidades cegas. O cassete contendo o gene de resistência à blasticidina foi excisado do vetor pBsR519 (Puta & Zeng, 1998) com a enzima EcoRV, liberando um fragmento de ~1,4kb que foi ligado na construção previamente linearizada.
3.7.3. Construção do pAE-DdI-2
Para testar a expressão do DdI-2 em bactérias utilizamos o vetor pAE (Ramos
et al., 2004). Este vetor confere uma cauda de seis resíduos de histidina e um
espaçador de 16 aminoácidos ao amino-terminal da proteína expressa. A expressão da proteína recombinante está sob controle do promotor T7 e apresenta como marca de seleção um gene que confere resistência a ampicilina. Para construção de pAE- DdI-2 (Figura 2C), o cDNA DdI-2 foi removido da construção pCR-DdI-2 com as enzimas BamHI e EcoRV e ligado no vetor pAE previamente linearizado com BamHI e PvuII. Como as enzimas EcoRV e PvuII geram extremidades cegas, estes sítios foram perdidos após a ligação.
3.7.4. Construção das iscas pGBKT7-DdPP1c, pGBKT7-DdPP1cF269C e pGBKT7-NcPP1c para ensaios de duplo-híbrido em leveduras
A porção codificadora da DdPP1c e DdPP1cF269C foram removidas da construção pTrcHisDdPP1 e pTrcHisDdPP1cF269C (Andrioli et al., 2003) com a enzima NdeI. Em seguida, subclonamos estes fragmentos no vetor pGBKT7 (Clontech) também digerido com NdeI (Figura 2D e 2E). Para subclonagem da NcPP1c, a seqüência codificadora (904pb) foi extraída da construção pAS-NcPP1c (Zapella, 2001) através de digestão com as enzimas de restrição NdeI e EcoRI. Esta digestão dupla permitiu que o inserto fosse removido e ligado direcionalmente no vetor do pGBKT7, previamente digerido com as mesmas enzimas (Figura 2F). O
vetor pGBKT7 expressa proteínas em fusão com os aminoácidos 1-147 do domínio de ligação a GAL4 (DNA-BD). Em levedura, as proteínas de fusão são expressas a partir do promotor constitutivo ADH1 (PADH1) e a transcrição terminada pelos sinais
de terminação de transcrição, T7 e ADH1 (TT7 & ADH1). A proteína de fusão é
direcionada para o núcleo da levedura através de uma seqüência de localização nuclear (SV40) adicionada a seqüência do domínio de ligação. O vetor também contém o promotor T7 e codifica o epitopo c-Myc em fusão com a proteína heteróloga. Além disso, pode se replicar tanto em E.coli quanto em S cerevisiae a partir de oriC e ori 2µ, respectivamente. As células transformadas com este vetor podem ser selecionadas com o antibiótico canamicina (kanr), no caso de bactéria e com o marcador nutricional triptofano (TRP1), no caso de levedura.
3.7.5. Construção das presas pGADT7-DdI-2, pGADT7-INc-1L e pGADT7-INc-1
Para subclonagem do DdI-2, a construção pCR-DdI-2 (Figura 2A) foi digerida com as enzimas ClaI e XhoI para retirada do inserto e ligação no vetor pGADT7 (Clontech) também digerido com estas duas enzimas (Figura 2G). As sequências codificadoras de INc-1L (1044pb) e INc-1 (933pb) foram extraídas das construções pCR-INc-1L e pCR-INc-1 (Beton, 2004) através de digestão com as enzimas de restrição NdeI e EcoRI. Os insertos removidos foram subclonados no vetor pGADT7 previamente digerido com as mesmas enzimas (Figura 2H). O vetor pGADT7 expressa proteínas em fusão com os aminoácidos 768-881 do domínio de ativação de GAL4 (DNA-AD). Em levedura, as proteínas de fusão são expressas a partir do promotor constitutivo ADH1 (PADH1) e a transcrição terminada pelos sinais de
terminação de transcrição ADH1 (TADH1). A proteína de fusão é direcionada para o
núcleo da levedura através de uma seqüência de localização nuclear (SV40) adicionada à seqüência do domínio de ativação. O vetor também contém o promotor T7 e codifica o epitopo HA em fusão com a proteína heteróloga expressa. Além disso, pode se replicar tanto em E.coli quanto em S cerevisiae a partir de oriC e ori 2µ, respectivamente. As células transformadas com este vetor podem ser selecionadas com o antibiótico ampicilina (Ampr), no caso de bactéria e com o marcador nutricional leucina (LEU2), no caso de levedura.
C)
D)
E)
A)
B)
F)
Figura 2. Esquema das construções plasmidiais. Continua na próxima página...
pCR2.1-DdI-2_ko 6126pb
DdPP1cF269C
pGBKT7-DdPP1cF269C
Figura 2. Esquema das construções plasmidiais.
A) pCR2.1-DdI-2: cDNA do DdI-2 de D. discoideum clonado no vetor pCR2.1. B) pCR2.1- DdI-2_ko: cDNA do DdI-2 clonado no vetor pCR2.1. O cDNA foi interrompido pela inserção
de um cassete que confere resistência ao antibiótico blasticidina no sítio da enzima MunI. C)
pAE-DdI-2: cDNA do DdI-2 subclonado no vetor de expressão pAE nos sítios BamHI e PvuII, o último foi perdido após a clonagem. Este vetor confere fusão com 6 resíduos de
histidina no amino-terminal da proteína expressa em bactérias. D) pGBKT7-DdPP1c: cDNA da DdPP1c subclonado no vetor de duplo-híbrido no sítio da enzima NdeI. O vetor pGBKT7 expressa proteínas em fusão com os aminoácidos 1-147 do domínio de ligação a GAL4 (DNA-BD). Apresenta o antibiótico canamicina (kanr) como marca de seleção em bactéria e o marcador nutricional triptofano (TRP1), no caso de levedura. E) pGBKT7-DdPP1cF269C: cDNA da DdPP1cF269C subclonado no vetor de duplo-híbrido no sítio da enzima NdeI. O vetor pGBKT7 expressa proteínas em fusão com os aminoácidos 1-147 do domínio de ligação a GAL4 (DNA-BD). Apresenta o antibiótico canamicina (kanr) como marca de seleção em bactéria e o marcador nutricional triptofano (TRP1), no caso de levedura. F)
pGBKT7-NcPP1c: cDNA da NcPP1c subclonado no vetor de duplo-híbrido nos sítios NdeI e EcoRI. O vetor pGBKT7 expressa proteínas em fusão com os aminoácidos 1-147 do
domínio de ligação a GAL4 (DNA-BD). Apresenta o antibiótico canamicina (kanr) como marca de seleção em bactéria e o marcador nutricional triptofano (TRP1), no caso de levedura. G) pGADT7-DdI-2: cDNA do DdI-2 subclonado no vetor de duplo-híbrido no sítio das enzimas ClaI e XhoI. O vetor pGADT7 expressa proteínas em fusão com os aminoácidos 768-881 do domínio de ativação de GAL4 (DNA-AD). Apresenta o antibiótico ampicilina (Ampr) como marca de seleção em bactéria e o marcador nutricional triptofano (LEU2), no caso de levedura. H) pGADT7-INc-1L ou INc-1: cDNA do INc-1L ou INc-1 subclonado no vetor de duplo-híbrido nos sítios NdeI e EcoRI. O vetor pGADT7 expressa proteínas em fusão com os aminoácidos 768-881 do domínio de ativação de GAL4 (DNA- AD). Apresenta o antibiótico ampicilina (Ampr) como marca de seleção em bactéria e o marcador nutricional leucina (LEU2), no caso de levedura.
G)
H)
pGADT7-INc-1L ou 9016pb pGADT7-INc-1