A extração de ADN das amostras foi realizada pelo método Chelex 100®, (BioRad), descrito em 1991 por Walsh e seus colaboradores (Walsh et al., 1991). O Chelex é uma resina quelante que apresenta uma elevada afinidade para iões metálicos polivalentes, o que permite a prevenção da degradação do ADN a elevadas temperaturas.
Começou-se por retirar 1 círculo, do cartão Whatman™ FTA™ (GE Healthcare) onde havia sido colhida a amostra, com um paper punch single hole e colocou-se em tubos eppendorf, previamente identificados. Aos tubos, adicionou-se 1mL de água Milli-Q e deixou-se a incubar à temperatura ambiente, durante cerca de 15 minutos. Agitaram-se os tubos no vortex, a uma baixa velocidade, durante 5 a 10 segundos, centrifugou-se a 14 000rpm durante 3 minutos a uma temperatura de 20ºC e retirou-se cerca de 960µL de sobrenadante de cada amostra.
Ao pellet foi adicionado 180µL de Chelex a 5%, previamente preparado, seguido de um banho de aquecimento a 56ºC durante 15 minutos. Procedeu-se a uma nova agitação, a alta velocidade, durante 10 a 15 segundos, seguida de um banho em ebulição durante 8 minutos. Realizou-se nova agitação a alta velocidade durante alguns segundos e nova centrifugação a 14 000rpm durante 5 minutos.
45 2.4. Estudo dos marcadores InDel
Para o estudo dos marcadores InDel foi utilizado o kit comercial, Investigator®DIPplex (QIAGEN), o qual permite analisar 30 marcadores InDel autossómicos e o gene da Amelogenina para a identificação do género.
O kit em uso contém todos os reagentes necessários ao estudo dos 30 marcadores InDel, como se pode observar na Tabela 2.4.1. Dos constituintes deste kit destaca-se a mistura de primers que permite a análise simultânea de todos os marcadores pelo facto destes primers marcados com fluorocromos que emitem fluorescência em quatro comprimentos de onda diferentes: no azul, no verde, no amarelo e no vermelho.
Tabela 2.4.1 – Constituintes do kit Investigator®DIPplex (QIAGEN)
Investigator®DIPplex
Mistura de reação A Marcador interno 550 (BTO) Mistura de primers DIPplex Ladder alélico DIPplex ADN polimerase Multi Taq2 Água livre de nucleases
ADN controlo 9948
Os marcadores InDel encontram-se distribuídos por 19 cromossomas e estão separados por pelo menos 10Mpb de cada marcador comercial utilizado na rotina da genética forense, STR e SNP (ver Tabela 1.8.3, página 38) (QIAGEN, 2013).
2.4.1. Amplificação por PCR multiplex
A amplificação dos 30 marcadores InDel e da Amelogenina decorreu numa única reação de PCR, denominada de PCR multiplex, onde é possível amplificar diferentes regiões do ADN numa única reação.
Para a reação de PCR multiplex, foi necessário preparar em primeiro lugar uma mistura de reação que contenha todos os componentes (incluídos no kit em uso) para que ocorra a amplificação dos marcadores em estudo. A mistura de reação é preparada para um volume de 10,5µL por amostra, aos quais se adiciona 2µL de solução com ADN alvo, perfazendo um volume final de reação de 12,5µL (da Silva et al., 2013). Para os controlos de reação, positivo e negativo, foi colocado, em vez do ADN alvo em estudo, ADN controlo 9947A (Applied Biosystems) para o controlo positivo e água livre de nucleases para o controlo negativo, nas mesmas quantidades.
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Tabela 2.4.2 – PCR multiplex. Reagentes e quantidades respetivas, necessários na preparação da
mistura de reação para a amplificação dos marcadores InDel.
Componente Volume por reação
Mistura de reação A 2, μl
Mistura de primers DIPplex 2, μl
Multi Taq2 ADN Polimerase 0, μl
Água livre de nucleases 5, μl
ADN alvo μl
Volume Total 12,5μl
A mistura de reação A contém os dNTPs necessários para a formação das novas cadeias de ADN, contem também MgCl2 que influencia a capacidade de ligação dos primers ao ADN e contem também BSA, utilizado para aumentar o rendimento da amplificação. A mistura de primers contém todos os primers necessários para a amplificação dos 30 marcadores InDel e Amelogenina, marcados com quatro fluorocromos diferentes: 6-FAM (azul), BTG (verde), BTY (amarelo) e BTR (vermelho) (QIAGEN, 2013).
A reação de amplificação decorreu num termociclador GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems), segundo as condições da Tabela 2.4.3, recomendadas para amostras em condições normais com 0,2 a 0,5ng de ADN.
Após a reação de amplificação pode-se guardar o produto amplificado a 4ºC durante um período de tempo reduzido, ou a -20ºC por longos períodos de tempo, ou pode-se seguir diretamente para a eletroforese capilar.
Tabela 2.4.3 – Condições de temperatura e tempo para que ocorra cada uma das fases necessárias
à amplificação dos marcadores InDel e Amelogenina no termociclador.
Temperatura Tempo 94ºC 4min 94ºC 30s 30 Ciclos 61ºC 120s 72ºC 75s 68ºC 60min 10ºC ∞
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2.4.2. Eletroforese Capilar do produto amplificado
O produto amplificado obtido é uma mistura dos fragmentos de ADN dos 30 marcadores em estudo, de diferentes pesos moleculares, sendo por isso necessário separar e detetar esses fragmentos por eletroforese capilar com marcação por fluorescência, com recurso ao sequenciador automático Genetic Analyzer 3130 xl (Applied Biosystems).
Antes de se proceder à eletroforese capilar em si, preparou-se as amostras em estudo numa placa de 96 poços, MicroAmp® Optical (Applied Biosystems). Foi preparada uma mistura para a eletroforese contendo formamida Hi-Di (Applied Biosystems) que mantem as cadeias de ADN desnaturadas, e contendo o marcador interno de peso molecular 550 (BTO) (Qiagen), para um volume final por poço de 9,2µL (M Fondevila et al., 2012). Após a distribuição das alíquotas por cada poço da placa adicionou-se 1µL de produto amplificado ou 1µL de ladder alélico, este último para permitir a identificação dos alelos aquando da análise. Procedeu-se em seguida a uma desnaturação a 95ºC durante 3 minutos, no termociclador GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems), seguida de um rápido arrefecimento em placa de gelo por mais 3 minutos, para que ocorra a separação das cadeias de ADN.
As condições da eletroforese capilar foram as especificadas pelo fabricante do kit, utilizando o polímero POP4® (Applied Biosystems).
Tabela 2.4.4 – Reagentes necessários para a preparação do produto amplificado param a
eletroforese capilar e os respetivos volumes por cada reação.
Reagente Volume por reação
Formamida Hi-Di 8,9µL
Marcador 550 (BTO) 0,3µL
Volume Total 9,2µL
2.4.3. Deteção e análise do produto amplificado
A análise da eletroforese capilar foi realizada no software GeneMapper versão 3.2 (Applied Biosystems), de acordo com as indicações do manual (QIAGEN, 2013). O limiar de deteção foi definido para um valor de 100 RFUs para os fragmentos marcados com fluorescência azul (B) e com fluorescência verde (G),
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50RFUs para os fragmentos marcados com fluorescência amarela (Y), vermelha (R) e cor de laranja (O). Em relações às condições de leitura foram definidas para um start point de 1 750pb e um stop point de 6 000pb.
Para a interpretação dos resultados, foi utilizado o freeware DIPSorter. (QIAGEN)
2.4.4. Alelos off ladder e dropout do alelo D97+
A confirmação e verificação de fenómenos detetados, como a presença de alelos off ladder e a ineficiente amplificação do alelo D97+, aquando a análise dos eletroferogramas obtidos, foi realizada por repetição da tipagem dos indivíduos onde foram estes foram detetados. Também para entender melhor a causa/efeito destes fenómenos, foram genotipados 10 filhos desses mesmos indivíduos. A paternidade fora confirmada de forma a garantir a ocorrência dos fenómenos na descendência.