A quantificação e o monitoramento de bactérias capazes de degradar compostos xenobióticos em solos contaminados através de metodologias de cultivo, frequentemente subestimam os resultados, devido à incapacidade de reproduzir as condições in situ e por cultivar a maioria dos microrganismos (Lloyd-Jones et al, 1999). Pesquisadores concluíram que bactérias cultiváveis representam apenas de 0,1 a 10% da população bacteriana total no ambiente (Amann et al., 1995; Hugenholtz et al., 1998). Neste contexto, a avaliação da biodiversidade utilizando técnicas convencionais, como o cultivo de bactérias em meio sólido, pode introduzir sérios erros de interpretação em estudos de ecologia microbiana (Wagner et al., 1994).
Técnicas moleculares têm sido empregadas para caracterizar os ácidos nucléicos dos microrganismos presentes na comunidade microbiológica de amostras ambientais, tendo como vantagem ser uma técnica direta a qual reflete a composição da comunidade microbiana nas condições in situ, pois as amostras são congeladas imediatamente após a coleta. Estas técnicas são capazes de representar de maneira mais precisa a diversidade microbiana presente no ambiente, incluindo os microrganismos que não são prontamente cultiváveis, mas que podem ser responsáveis pelas atividades de biodegradação dos poluentes de interesse (Brockman, 1995).
Técnicas baseadas em PCR (Polymerase Chain Reaction), como a amplificação de fragmentos do gene RNAr 16S e a posterior desnaturação destes fragmentos utilizando a eletroforese DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), têm sido aplicadas para avaliar a diversidade de amostras ambientais e monitorar as alterações nas comunidades microbianas (Muyzer,G e Smalla, K (1998).
A técnica de PCR, ou reação de polimerização em cadeia, consiste na amplificação de uma cadeia específica de DNA, utilizando a enzima Taq DNA polimerase como catalisador da reação e oligonucleotídeos sintéticos (primers), como iniciadores. Ocorrem nas seguintes etapas (correspondendo a um ciclo):
1. Desnaturação: separação da dupla fita de DNA;
3. Extensão: adição de nucleotídeos produzindo a amplificação da seqüência inicial
A enzima Taq DNA polimerase processa cerca de 1000 bases/minuto à temperatura de 72ºC; já os primers apresentam 20 a 30 bases de extensão e a seleção dos mesmos, juntamente com o DNA alvo, definirá as condições da reação (tempos, temperaturas e número de ciclos).
A técnica de fingerprint DGGE consiste na extração dos ácidos nucléicos, DNA, das células dos microrganismos presentes na amostra, seguida de amplificação por PCR de uma região específica do DNA e posterior separação dos fragmentos amplificados em géis de poliacrilamida. Esta separação de fragmentos de DNA de mesmo tamanho ocorre em função da composição diferente de bases nitrogenadas das seqüências de DNA, o que confere comportamentos de desnaturação diferentes em um gel contendo um gradiente progressivo de agentes desnaturantes. Desta forma, estes fragmentos de DNA com composição diferente, que correspondem potencialmente a espécies distintas de microrganismos, param de migrar em posições diferentes no gel e resultam em um perfil de bandas que reflete a complexidade da comunidade presente na amostra.
No gel de DGGE, o número, a posição exata e a intensidade das bandas dão uma estimativa indireta da riqueza e abundância relativa dos ribotipos (perfis de bandas de fragmentos de DNAr 16S) dominantes em uma amostra, possibilitando comparar diferentes comunidades. No entanto, as comunidades presentes no solo, lodo e sedimentos normalmente são muito complexas, e muitas vezes, espécies menos abundantes, porém importantes, podem não ser detectadas por esta técnica molecular (Heuer et al., 1997).
Eichner et al. (1999) afirmaram que as bandas de DGGE não necessariamente representam o número e a abundância das espécies presentes em uma comunidade microbiana, pois um organismo pode produzir mais de uma banda devido à multiplicidade e heterogenia de genes de RNAr. Adicionalmente, sequências parcias de DNAr 16S nem sempre permitem discriminação entre espécies, assim uma banda de DGGE pode representar várias espécies com seqüências de DNAr idênticas (Muyzer et al., 1998).
Estas deficiências da técnica sugerem que os resultados do DGGE devem ser interpretados apenas como indicadores do grau de diversidade em uma comunidade bacteriana.
Ainda assim, a técnica oferece grande sensibilidade, rapidez, eficiência e capacidade de representar razoavelmente as variações em uma comunidade microbiana em um determinado sistema (Kaewpipat & Grady, 2002), o que a torna uma excelente ferramenta para monitoramento da dinâmica de populações microbianas.
Engelen et al. (1998) monitoraram o impacto de dois herbicidas (Herbogil e Goltix) e um óleo mineral no ecossistema do solo, através de técnicas tradicionais (respiração substrato-induzida-SIR, atividade dehidrogenase, consumo do carbono e nitrogênio) e verificaram alterações na estrutura da comunidade bacteriana, através das técnicas de DGGE. Foram retiradas amostras de um solo utilizado anteriormente para fins agrícolas, porém não contaminado, nos primeiros 10 cm de profundidade. O solo apresentava textura arenosa (12,9% argila, 37,7% silte e 49,4% areia), COT de 1,16%, pH (KCl 0,1 N) de 5,6-6,8 e capacidade de campo de 23,7 g/100gsoloseco. As amostras foram secas e peneiradas (malha 2mm). Os testes foram conduzidos adicionando 5mL contaminante/1000 gsoloseco, utilizando três contaminantes em diferentes ensaios e o controle (5 mLágua/1000g soloseco). Os reatores foram mantidos a 20 ºC, no escuro, com 60% de umidade. Foram retiradas amostras após 1, 2, 5 e 8 semanas.
Verificando os efeitos dos herbicidas e óleo mineral através das técnicas denominadas tradicionais, os pesquisadores concluíram que o herbicida Herbogil causou os maiores efeitos na biomassa do solo: redução de 22% na respiração induzida e de 44% na atividade dehidrogenase quando comparados aos resultados obtidos no controle, sendo os efeitos na respirometria observados somente após 2 semanas. Os autores não observaram diferenças significativas na mineralização do nitrogênio em relação ao controle.
Analisando os resultados dos fingerprints de DGGE das amostras após 8 semanas (Figura 15), os pesquisadores verificaram alterações na estrutura bacteriana em relação àquelas do controle, causadas principalmente pelo herbicida Herbogil e o óleo mineral, já as bandas obtidas no fingerprint das amostras do solo contaminado com Goltix apresentaram similaridade com àquelas do controle.
Figura 15 – Comparação dos fingerprints de amostras de solo controle e contaminadas com diferentes herbicidas e óleo
Fonte Adaptado de Engelen et al.(1998)
Os autores concluíram que as técnicas moleculares são complementos valiosos àquelas tradicionais: enquanto esta última avalia os parâmetros relacionados à biomassa total, a primeira avalia exclusivamente os impactos na comunidade bacteriana exposta à variações ambientais.