O presente estudo constatou a enorme riqueza peptídica/protéica da secreção cutânea de L. labyrinthycus, sendo esta uma possível fonte de peptídeos com as mais diversas funções biológicas. Toda essa variedade possui relevante potencial para o desenvolvimento de novas drogas, principalmente contra bactérias ou células tumorais resistentes aos fármacos convencionais.
Os peptídeos antimicrobianos caracterizados neste trabalho, fallaxin e pentadactylin, haviam sido previamente purificados da secreção de L. fallax e L. pentadactylus respectivamente por outros grupos de pesquisa. A presença dos mesmos PAMs em três espécies diferentes sugere a importância evolutiva dessas macromoléculas, indicando também que os mesmos possuem outras funções igualmente importantes como a antibacteriana. Nossos resultados mostraram que os dois peptídeos são ativos contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, além de não apresentarem atividade hemolítica significativa.
A divergência dos resultados antimicrobianos e de toxicidade celular deste trabalho com relação a trabalhos de outros pesquisadores evidencia a necessidade de padronização de um protocolo único e com condições que viabilizem comparações posteriores.
Como verificado para outros PAMs de anfíbios, os peptídeos fallaxin e
pentadactylin também são anticarcinogênicos. A descoberta de novas moléculas antitumorais
é de extrema importância e urgência devido ao surgimento de resistência aos quimioterápicos disponíveis no mercado. Infelizmente, ambos os peptídeos são pouco seletivos para células de câncer, tendo apresentado o menor IC50 para células de fibroblasto normais, portanto o seu uso terapêutico deverá ser acoplado a mecanismos que reduzam a toxicidade dos mesmos.
Os resultados dos estudos do mecanismo de ação de pentadactylin contra a linhagem celular de câncer de mama MCF-7 sugerem que uma das vias de morte celular induzida por este peptídeo é a apoptótica, já que algumas características de apoptose inicial foram observadas nas células tratadas com uma dose equivalente ao IC50. Contudo, células de MCF- 7 tratadas com 128 µM do peptídeo perderam completamente a integridade da membrana celular, podendo essa observação ser resultado do processo apoptótico avançado ou de morte celular por necrose. No último caso, o processo necrótico aconteceria após o início da via apoptótica, de forma dependente da concentração do peptídeo, sugerindo a inviabilização celular pelo mecanismo poro toroidal/carpet-like. Todavia, essas são apenas sugestões,
109 necessitando-se de maiores estudos para chegar a conclusões sobre o verdadeiro mecanismo de ação do PAC pentadactylin.
Apesar da maioria dos estudos de secreção glandular de anfíbios investigar peptídeos biologicamente ativos, verificou-se a presença de importantes componentes enzimáticos. Notou-se a presença de enzimas proteolíticas pertencentes, provavelmente, ao grupo das metalo- e serino-peptidases, as quais atuam de maneira ótima em pH neutro a ligeiramente básico. Verificou-se no ensaio gelatinolítico a presença de duas bandas de atividade proteolítica dependentes de cálcio e inibidas por EDTA e excesso de zinco, características de metalo-peptidases. Além da atividade proteolítica, uma fraca atividade fosfolipásica também foi detectada. Ainda não se sabe a verdadeira importância dessas proteínas, podendo estar envolvidas no processamento dos peptídeos biologicamente ativos presentes no veneno ou atuar como um mecanismo de defesa. Assim, este é um campo praticamente inexplorado, capaz de gerar inúmeros resultados interessantes e importantes para a melhor compreensão da biologia dos anfíbios.
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8. Perspectivas
Como verificado nas análises por MALDI-TOF MS, a secreção cutânea de
L. labyrinthicus é riquíssima em peptídeos. Além dos dois peptídeos com atividade biológica
caracterizados neste trabalho, outros peptídeos responsáveis pela atividade hemolítica observada em algumas frações ainda precisam ser purificados e caracterizados tanto química como biologicamente. Além disso, outros ensaios preliminares de atividade biológica podem ser realizados buscando moléculas com diferentes funções, por exemplo, antiparasitária e antiviral.
Brevemente será realizado um ensaio antimicrobiano, testando-se em conjunto os peptídeos pentadactylin e PGL-Ll para verificar a hipótese levantada de que, apesar da falta de atividade antibacteriana detectada para o último, possa ocorrer uma ação sinérgica entre os dois.
Neste trabalho, o perfil peptídico da secreção estudada baseia-se apenas nas massas moleculares; a obtenção da estrutura primária dessas moléculas aumentará a fonte de dados disponíveis para elucidar questões taxonômicas do grupo dos leptodactilídeos, facilitando também a identificação de peptídeos com atividades em potencial.
Experimentos de atividade com os fragmentos Flx-16 e Flx-22 poderão ser realizados seguindo-se o protocolo utilizado por Dourado et al. (2007) no estudo dos fragmentos de syphaxin, extremamente parecidos com os de fallaxin, todavia detentores de uma potente atividade antibacteriana. Assim, será possível determinar até onde as condições do ensaio influenciaram no resultados de ausência de atividade detectada para esses fragmentos.
Para o maior conhecimento do padrão de clivagem dos PAMs pelas peptidases do veneno estudado, os fragmentos prováveis dos PAMs isolados poderão ser confirmados por seqüenciamento.
Muito ainda deve ser esclarecido acerca da atividade anticarcinogênica dos peptídeos fallaxin e pentadactylin. Logo deverão ser feitos outros experimentos para determinação do mecanismo de ação do PAC pentadactylin, como análise morfológica por microscopia eletrônica e estudos com anexina V, além de testar outras concentrações do peptídeo. Ensaios para verificar se o peptídeo entra ou não na célula também são de extrema relevância. Os mesmos ensaios serão realizados com o peptídeo fallaxin, o qual já se encontra sintetizado.
111 Tendo em vista a citotoxicidade de fallaxin e pentadactilin para células normais de fibroblasto, a qual não foi observada para eritrócitos humanos, torna-se necessário a verificação da toxicidade desse peptídeo para outras células normais por meio de um protocolo que possibilite comparações posteriores. Caso a citotoxicidade seja confirmada, esse problema poderá ser minimizado, por exemplo, pela construção de análogos com D- e L-
aminoácidos com maior especificidade para células tumorais.
Quanto aos estudos acerca das enzimas presentes na secreção cutânea da rã-pimenta, muito ainda tem a ser feito. Outras condições podem ser utilizadas para verificar a atividade proteolítica do veneno, por exemplo, a influência da temperatura e da força iônica sobre a atividade. Para identificar a que grupos pertencem às proteínas detectadas na zimografia, o gel poderá ser incubado com diferentes inibidores. Futuramente, as enzimas proteolíticas e fosfolipásicas responsáveis pelas atividades detectadas poderão ser purificadas e sua estrutura primária determinada.
Apesar da diversidade funcional dos peptídeos antimicrobianos atrair a atenção para que sejam fontes de novas drogas, o caminho para o seu uso clínico é longo e cheio de entraves. Algumas das dificuldades enfrentadas são o elevado custo de produção e a susceptibilidade às enzimas proteolíticas. Portanto, concomitantemente à descoberta de novos peptídeos biologicamente ativos, deve-se desenvolver novas estratégias capazes de sanar os problemas existentes e aumentar a seletividade e a potência dessas fascinantes moléculas.
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