A concentração de dióxido de carbono dissolvido é importante na determinação da produtividade de uma fermentação, sendo em alguns casos tão importante como a concentração de oxigénio dissolvido (Royce e Thornhill, 1991 citando Nyiri e Lengyel, 1968). Uma vez que há uma ligação directa entre o consumo de oxigénio e a produção de dióxido de carbono, a medição da taxa de produção de dióxido de carbono (CER) pode ser também um bom indicador da actividade metabólica e uma forma para o cálculo de parâmetros cinéticos em várias condições (Spérandior e Paul, 1997).
A taxa de produção de dióxido de carbono pelas bactérias reflecte uma série completa de reacções bioquímicas, as quais constituem o processo de respiração dos organismos. A inibição deste processo altera a quantidade de dióxido de carbono produzido que se encontra no meio de cultura aquoso. (Jardim, 1990)
Alguns autores seguem a evolução da actividade microbiana através da taxa de produção do dióxido de carbono, seja analisando a fase líquida (Jardim, 1990), ou a fase gasosa (Buitrón, 1992). Existem, contudo, alguns factores que afectam a evolução da quantidade de dióxido de carbono, podendo conduzir a interpretações incorrectas. Estas perturbações não reflectem variações reais na taxa de evolução do dióxido de carbono microbiano, mas apenas efeitos físicos (Royce, 1992).
O equilíbrio dinâmico do dióxido de carbono num sistema de fermentação aquosa é afectado pelo pH e pela pressão. Um aumento de pH, ou de pressão, resulta numa descida repentina e momentânea da concentração de dióxido de carbono e vice versa (Yegneswaran
et al., 1990).
1.3.3.4 Quociente de Respiração
A taxa volumétrica de produção de dióxido de carbono (CER) quando combinada com a taxa de consumo de oxigénio (OUR) permite a determinação do quociente de respiração (QR). Este parâmetro, definido como a razão entre o CER e o OUR, pode fornecer informação importante ao nível do metabolismo da cultura (Yegneswaran et al., 1990). Quando acompanhado em tempo real, uma alteração no seu valor durante uma fermentação, indica uma provável alteração ao nível das vias metabólicas (Ferreira et al., 1998).
Govind e colaboradores (1997) mediram, durante a biodegradação de fenol os parâmetros OUR e CER. Inicialmente o OUR é devido à biodegradação aeróbia do fenol, resultando na formação de dióxido de carbono e crescimento de biomassa, e o valor de QR é praticamente 1 (Govind et al., 1997, Ferreira et al., 1998). Neste caso, a degradação primária e a mineralização (degradação última) são iguais (Govind et al., 1997). A partir do valor máximo do OUR, verifica-se um consumo de oxigénio mais lento, principalmente devido à degradação da biomassa e dos produtos metabólicos, ocorrendo o aumento de QR (QR>1) (Govind et al., 1997).
Em geral, se o produto formado é bastante mais reduzido do que o substrato, o valor de QR com formação de produto, será superior ao seu valor na ausência de formação de produto. Por outro lado, se o produto fôr mais oxidado do que o substrato, o valor de QR será mais baixo (Ferreira et al., 1998).
2. OBJECTIVO
O presente trabalho teve por objectivo verificar a influência do dióxido de carbono nos processos de biodegradação, em particular nas condições em que funciona o reactor “Fed- Batch” Proporcional. Ou seja, num tipo de reactor em que a taxa de alimentação é função da pressão provocada pela acumulação dióxido de carbono produzido no decurso da degradação aeróbia de um composto orgânico, no presente caso, acetato de sódio.
3. PLANO EXPERIMENTAL
Para determinar a possível influência do dióxido de carbono que se acumula no reactor “Fed-batch” Proporcional (reactor fechado), devido ao aumento da respectiva pressão durante os testes de biodegradabilidade, realizaram-se ensaios com dois tipos de reactores: reactor “Fed-batch” Proporcional (fechado), designado por “F”, e reactor “Fed-batch” Aberto, “R”. O reactor F foi o primeiro a ser inicializado. Este reactor permite a adição de substrato através da acumulação dos produtos gasosos libertados no decurso da actividade dos microrganismos - CO2. Em paralelo, desfasado no tempo em cerca de uma hora e meia,
reproduz-se o mesmo ensaio, ou seja, nas mesmas condições iniciais, num reactor geometricamente semelhante, mas aberto (à pressão atmosférica), designado por R. Neste reactor a alimentação é realizada por meio de uma bomba peristáltica à mesma taxa de alimentação ocorrida no reactor F. Esta taxa de alimentação é reajustada ao longo do ensaio com a informação recolhida no reactor F, razão pela qual o reactor aberto é desfasado no tempo.
Os ensaios realizados pretenderam estudar diferentes condições iniciais, isto é, diferentes gamas de concentração de biomassa e diferentes concentrações do substrato a biodegradar. Nos Quadros 3.1 e 3.2 e na Figura 3.1 mostram-se as condições iniciais dos ensaios realizados.
Numa segunda fase, pretendeu-se despistar a hipótese de uma possível influência provocada pelo aumento dos iões bicarbonato, através de um ensaio “batch”.
O dióxido de carbono produzido pelos microrganismos acumula-se na fase gasosa na forma de CO2 e na fase líquida na forma de CO2 livre e HCO3-. Para determinar a influência dos
bicarbonatos realizou-se um ensaio com dois reactores “batch” paralelos abertos, com as mesmas condições iniciais, à excepção de um incremento de 500 mg/L de alcalinidade (expressa em CaCO3) em iões bicarbonato, no reactor designado por β, em oposição ao
reactor α, onde não foi adicionada qualquer outra substância. A solução alcalina utilizada era constituída por bicarbonato de sódio. O Quadro 3.3 resume as condições iniciais destes ensaios.
A biomassa utilizada nestes ensaios proveio de dois inóculos: A e B.
Quadro 3.1 - Resumo dos Ensaios “Fed-batch”
Concentração da solução de alimentação ([SAL]) Quantidade
inicial de biomassa (Xo)
6g ac. acético/L 8g ac. acético /L 12g ac. acético /L
Xo<1000mg 7, 10 8, 9, 11
1000<Xo<2000mg 2, 6 1, 3, 5
Xo>2000mg 4
Quadro 3. 2 - Condições Iniciais dos ensaios “Fed-batch”
Ensaio [SAL] [So] [Xo] So/Xo Inóculo
g ac. acético /L mg ac. acético /L mg SSV/L mg ac. acético/mg SSV
F1 12,113 810 1843 0,44 Ac R1 12,302 248 1719 0,14 Ac F2 5,535 367 1433 0,26 Ac R2 5,535 318 1407 0,23 Ac F3 12,859 315 1033 0,30 Al R3 12,859 270 989 0,27 Al F4 8,086 313 2254 0,14 B R4 8,086 297 2098 0,14 B F5 12,703 314 1208 0,26 B R5 12,703 411 1253 0,33 B F6 6,053 304 1161 0,26 B R6 6,053 315 1281 0,25 B F7 5,752 327 641 0,51 B R7 5,752 320 604 0,53 B F8 12,148 310 676 0,46 B R8 12,148 312 667 0,47 B F9 11,769 302 617 0,49 B R9 11,769 307 595 0,52 B F10 5,898 296 589 0,50 B R10 5,898 314 585 0,54 B F11 11,404 297 583 0,51 B R11 11,404 293 609 0,48 B
Ac inóculo com aproximadamente 21 dias de aclimatação e congelado
Al inoculo nas mesmas condições de aclimatação que Ac, embora tendo sido liofilizado B biomassa cuja aclimatação durou 15 dias, sendo conservada por congelação
Figura 3. 1 - Condições Iniciais dos ensaios “Fed-batch” realizados no estudo [So] 0 200 400 600 800 1000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ensaio [S o] m g ác. acé ti co /L
F - R.Fed-Batch Proporcional R - R. Fed-Batch Aberto
[Xo] 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ensaio [X o ] mg S S V /L
F - R.Fed-Batch Proporcional R - R. Fed-Batch Aberto
So/Xo 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ensaio So /X o mg á c .A c é ti c o /mg S S V
F - R.Fed-Batch Proporcional R - R. Fed-Batch Aberto
[SAL] 0 2 4 6 8 10 12 14 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ensaio [S A L ] g ác. acé ti co /L
Quadro 3.3 - Estudo da influência dos bicarbonatos - condições iniciais dos ensaios
Ensaio [So] [Xo] So/Xo Alcalinidade
adicionada
Inoculo
mg ac. acético/L mg SSV/L mg ac. acético/mg SSV mg CaCO3/L
α 2317 1445 1,60 0 B
β 2470 1569 1,57 500 B
B biomassa cuja a aclimatação durou 15 dias sendo conservada por congelação
Optou-se por não realizar ensaios com gamas de biomassa mais elevadas, uma vez que seria expectável uma maior produção de dióxido de carbono, o que levaria a que os ensaios decorressem num tempo muito curto, pois rapidamente se atingiria o limite de funcionamento do ensaio “Fed-batch” Proporcional, isto é, os 22 centímetros de coluna de líquido, o que não permitiria a obtenção de dados suficientes.
65
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 PRODUÇÃO DE INÓCULOSCom base na experiência já existente no Laboratório de Sistemas de Tratamento da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (FCT/UNL) relativamente à produção e manutenção de inóculos para posterior utilização em ensaios de biodegradabilidade, procedeu-se à aclimatação e produção de novos inóculos a partir de lamas biológicas de uma Estação de Tratamento de Águas Residuais Domésticas pelo sistema de lamas activadas. Com efeito, era necessário garantir, nesta fase de desenvolvimento dos trabalhos, uma quantidade suficiente de biomassa para realização dos ensaios deste estudo.
O processo de aclimatação consistiu basicamente nas seguintes etapas: as lamas provenientes da recirculação de lamas da ETAR de Montelavar, foram arejadas e seguidamente crivadas por uma malha de 75 µm. Após a decantação do crivado, uma parte das lamas resultantes foram aclimatadas com acetato de sódio em sistema semi-contínuo. A produção de inóculos caracterizou-se por um período de arejamento (ta) de 22 horas, seguido de um o período de decantação (ts) de 2 horas após o qual se retirava o sobrenadante e se adicionava nova solução de alimentação, perfazendo o volume. A população mista adaptada cresceu a uma concentração de carbono de 1000 mg/L.
Este procedimento foi realizado por duas vezes. Para um primeiro inóculo, a biomassa esteve durante 21 dias no sistema semi-contínuo, ao fim dos quais uma parte da biomassa foi congelada e a restante foi liofilizada. Estes inóculos foram designados de Ac (congelado)
e Al (liofilizado). Uma segunda aclimatação, que durou 15 dias em sistema semi-contínuo
com características semelhantes às anteriormente apresentadas, foi designada por B.
Durante a aclimatação e produção de inóculos analisou-se a concentração de substrato (acetato de sódio) por Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC - High Pressure
Liquid Chromatography) determinando o ácido acético em solução e a concentração de
66 gravimétrico e por leitura da densidade óptica. Os SSV correspondem a uma medida directa da biomassa.
4.2 MEIO DE CULTURA
A composição do meio de cultura foi semelhante em todas as fases deste estudo (produção de inóculos, ensaios de biodegradabilidade), variando unicamente a concentração em que os seus constituintes se encontravam.
O meio mineral utilizado resultou de ensaios anteriormente realizados no laboratório (Sequeira e Santana, 2002) sendo adaptado a partir da composição do meio mineral segundo Dang e colaboradores (1989). De modo a garantir que a única fonte de carbono disponível era o acetato de sódio, retirou-se da composição do referido meio o extracto de levedura. Enriqueceu-se este meio base com uma solução de oligoelementos de composição semelhante à do meio mineral descrito na Norma AFNOR T 90-306 (Ensaio de biodegradabilidade “última” - Método por análise do CO2 libertado). Este é um meio
normalmente usado em testes de degradação, composto por tampões de fosfato, azoto, e fósforo e outros compostos minerais, que consta igualmente da Portaria n.º 732-A/96 de 11 de Dezembro, que aprova o Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas.
Assim, a fonte de carbono e energia era fornecida através da solução de acetato de sódio. Com o objectivo de garantir que não havia limitações de nutrientes, adicionava-se ao meio de cultura uma solução de cloreto de amónia, para fornecer azoto. Na solução de alimentação garantia-se uma razão C/N de 20 recomendada, para processos aeróbios (Casey, 1997 citando Pipes, 1979).
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Quadro 4.1 - Composição do meio de mineral e das fontes de carbono e azoto (Sequeira e
Santana, 2002)
Composição Concentração da solução mãe Volume de preparação da solução de alimentação base (5gC/L) (g/L) (mL) MEIO MINERAL Sol. Tampão 50 KH2PO4 8,500 K2HPO2 21,750 Na2HPO4.7H2O 33,400 NH4Cl 1,700
Sol. Sulfato de Magnésio heptahidratado
5
MgSO4.7H2O 22,500
Sol. Cloreto de Cálcio anidro 5
CaCL2.2H2O 36,430
Sol. Cloreto Férrico hexahidratado 5
FeCl3.6H2O 0,250 Sol. Oligoelementos 5 MnSO4.4H2O 0,040 H3BO3 0,060 ZnSO2.7H2O 0,040 C10H12FeN2NaO8.3H2O 0,032 (quelato de ferro)a 0,100 FONTE DE AZOTO 12,5
Sol. Cloreto de amónia (20g N/l)
NH4Cl 76,410
FONTE DE CARBONO 250
Sol. Acetato de sódio (20g C/l)
C2H3O2Na.3H2O 113,400
a
Esta solução é obtida por mistura de 0,0555g de EDTA sal dissódico (C10H14N2Na2O8.3H2O) e 0,0445g de Cloreto Férrico (FeCl3.6H2O)
68 O meio de cultura utilizado tinha uma composição correspondente à solução de alimentação base, cuja concentração em carbono era de 5 g/L (teoricamente 12,5 g/L, expresso em ácido acético). Outras concentrações utilizadas resultaram de diluições da solução de alimentação base.
4.3 REACTOR “FED-BATCH” PROPORCIONAL