5.1. Este trabalho descreve pela primeira vez um biossensor amperométrico de segunda geração, para detecção de antibióticos -lactâmicos, baseado na modificação de uma pasta de carbono com a enzima -lactamase da classe B (uma metalo-enzima) e com o mediador de elétrons CoPc.
Os estudos realizados evidenciaram que o uso da pasta de carbono com a enzima presente concomitantemente com o mediador geram um efeito sinérgico na redução do analito, a qual permite obter um limite de quantificação de 15,3 ppm e repetibilidade intra-dia (RSD, n = 5) igual a 3,4 %, sendo estes resultados satisfatórios pelo fato de não ter sido realizado pré-tratamento da amostra, tornando a aplicação da metodologia simples .
5.2. Embora ainda devam ser realizados ajustes para diminuir o limite de detecção (LOD = 4,6 ppm) e poder concorrer com o kit comercial (LOD = 1 a 2 ppb) usado na indústria de alimentos, esta primeira tentativa se mostra bastante promissora, uma vez que outras alternativas para a construção do biossensor poderão ser exploradas. Como por exemplo, usar nanotubos de carbono (NTC), modificar eletrodos impressos contendo NTC, CoPc e enzima ligada covalentemente, ou ainda, uma proposta que já está sendo elaborada neste grupo de pesquisa, envolvendo o uso de eletrodos de ouro com monocamadas auto-organizadas (Anexo).
REFERÊNCIAS
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30 AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução RE n. 899: guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 29 maio 2003. Disponível em: <www.anvisa.gov.br>. Acesso em: 30 nov. 2010. 31 BONI, A. C.; WONG, A.; DUTRA, R. A. F.; SOTOMAYOR, M. D. P. T. Cobalt phthalocyanine as a biomimetic catalyst in the amperometric quantification of dypirone using FIA. Talanta, v. 85, p. 2067-2073, 2011.
ANEXO 75
Anexo – Resumo aceito no 63rd Annual Meeting of the International Society of
Electrochemistry, que será realizado em Agosto de 2012.
Development of enzymatic biosensor for direct detection of penicillin
in milk samples
Marcos Vinicius Foguel, Thiago Martimiano do Prado, Antonio Ap. Pupim Ferreira, Maria Del Pilar Taboada Sotomayor
Instituto de Química - Universidade Estadual Paulista (UNESP) Rua Professor Francisco Degni, 55 - 14800-900 - Araraquara/SP – Brazil
This work reports by the first time a third generation biosensor for detection of penicillin, based on a gold screen printed electrode (Au-SPE) modified with penicillinase enzyme immobilized on a SAM of cystamine. The interaction with the antibiotic Penicillin G (substrate) was investigated by cyclic voltammetry (CV) and amperometry.
The construction of biosensor was performed modifying the working electrode of Au-SPEs (model AC1.W1.RS, batch Z702, BVT Technologies, Czech Republic) with 0.02 mol L-1 cystamine (tincub = 2h) and with penicillinase enzyme (100 U) immobilized on the SAM (overnight). The SPE consisted of Au–2wt.%Pd (Ageom = 0.0035 cm2), Ag– 2wt.%Pd (Ageom = 0.137 cm2) and Au–2wt.%Pd (Ageom = 0.072 cm2) as working, reference and auxiliary electrodes, respectively. The electrochemical measurements were carried out in 0.05 mol L-1 phosphate buffer solution at pH 7.4. All experiments were repeated at least three times at 25 °C.
The first results in CV showed the increase of the reduction current from -390 mV for enzyme-substrate reaction. Then, with the aim at to perform analytical applications the applied potential was optimized, obtaining the better response at -450 mV, resulting in a calibration curve with good linear range between 4.7 x 10-4 to 4.9 x 10-3 mol L-1 (R = 0.998, n=3) and LOD and LOQ of 1.68 x 10-4 and 5.05 x 10-4 mol L-1, respectively. It is worth mentioning that this biosensor does not require the use of electron mediators, due to that the analysis is performed by direct electron transfer between the enzyme and the substrate. In addition, is not known any biosensor for detection of penicillin, based on β-lactamase. Currently, is been analyzed the performance of this biosensor in milk samples contaminated with this antibiotic, in order to evaluate the potential of applicability of this biosensor.