Mekanisert fiksering, veiing og sortering av dyr

Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima presente predominantemente nos grânulos azurófilos dos neutrófilos e tem sido utilizada como um marcador quantitativo da infiltração de neutrófilos nos processos inflamatórios (POSADAS et al., 2004).

Nossos resultados mostraram que as doses de 3 ou 9 mg kg-1 foram capazes de inibir a atividade da MPO (p<0,05), diminuindo assim a infiltração de neutrófilos quando comparado com o grupo Cg, enquanto que a dose de 27 mg kg-1 não foi capaz de inibir (p>0,05) a atividade da MPO quando comparada com Cg (Figura 19). Portanto, estes resultados corroboram com os de edema de pata, induzido por Cg, que mostrou atividade antiinflamatória apenas para as doses de 3 ou 9 mg kg-1.

Figura 19. Atividade da mieloperoxidase (MPO) no sobrenadante do homogenato das secções da pata administrada com Carragenana (Cg), PST de G. cornea (3, 9 ou 27 mg kg-1), dexametasona ou salina estéril (s.c.), expressa em unidade de MPO U mg-1 dos tecidos. Os dados estão expressos como média ± s.e.m. de seis ratos para cada grupo.* P <0,05 indica diferença significativa entre o grupo carragenana (ANOVA; Bonferroni).

5.3.4.4. Efeito dos PST de G. cornea no modelo de edema de pata induzido por dextrana

A dextrana é um agente pró-inflamatório que promove a liberação de aminas vasoativas, como a histamina e serotonina causando um edema osmótico, sendo caracterizada por um aumento da permeabilidade vascular e ocasionando baixos níveis de proteínas e de neutrófilos (LO et al, 1982).

Como mostrado na figura 20, a administração da dextrana atingiu um pico máximo nos primeiros 30 min (0,96 ± 0,07 mL), sendo seu efeito reduzido nas horas subseqüentes do ensaio.

O tratamento com os PST (3, 9 e 27 mg kg-1) de G. cornea demonstrou ser eficaz em reduzir a formação do edema induzido por dextrana de maneira significativa (p<0,05), principalmente nos primeiros 30 min e na primeira hora do ensaio. Nos primeiros 30 min, as doses 3, 9 e 27mg kg-1 exibiram um percentual de redução em 52,8% (0,56 ± 0,10 mL), 47,3% (0,58 ± 0,05 mL) e 40,2% (0,60 ± 0,09 mL), respectivamente, quando comparadas com a dextrana (0,96 ± 0,07 mL). Enquanto que na primeira hora as referidas doses apresentaram um percentual de redução em 67,6% (0,24 ± 0,04 mL), 59,7% (0,29 ± 0,08 mL) e 52,7% (0,34 ± 0,05 mL), respectivamente, quando comparadas com a dextrana (0,71 ± 0,10 mL).

Figura 20. Efeito dos PST de G. cornea no edema de pata induzido por dextrana em ratos. Antes de receber a injeção de dextrana (100

μL; 400 μg pata-1

; s.c.), grupos de animais receberam PST nas doses (3, 9 ou 27 mg kg-1). Outro grupo recebeu apenas salina sem dextrana. Os dados estão expressos como média ± s.e.m. de seis ratos para cada grupo. * P <0,05 indica diferença significativa entre o grupo de dextrana (ANOVA; Bonferroni).

Os efeitos antiedematogênicos dos PST de G. cornea também foram observados para um PS da alga marinha parda L. variegata, que na dose de 1mg kg-1 inibiu a formação do edema, induzido por dextrana (1,22 ± 0,06 mL), em aproximadamente 19% (0,98 ± 0,06 mL) nos primeiros 30 min do ensaio (SIQUEIRA et al., 2010).

Contrariamente aos nossos resultados, Assreuy et al. (2008) ao avaliarem os efeitos de um PS da alga marinha vermelha C. feldmannii sobre a inflamação, administrado nas doses de 0,1 mg kg-1 e 0,3 mg kg-1, antes da injeção de dextrana, constataram uma potencialização do edema induzido por este agente na primeira e quarta horas, após o estímulo.

Posteriormente, Assreuy et al. (2010) avaliando a atividade de um PS da alga marinha vermelha S. filiformis, utilizando o modelo descrito acima, observaram que o pré-tratamento com o PS não foi capaz de inibir o edema induzido pelo agente flogístico dextrana em todos os tempos avaliados. Entretanto, quando o PS da alga S. filiformis (1 mg kg-1; s.c.) foi injetado nas patas dos animais induziu edema de pata num curso de tempo que foi significativamente mantido até 4 hora.

Nossos resultados sugerem que o efeito antiedematogênica dos PST de G.

cornea na dose mais elevada esteja relacionado com os eventos inflamatórios que

envolvem a inibição do edema osmótico e pode envolver a inibição de vários mediadores, como histamina, serotonina, bradicinina e prostaglandinas. Enquanto que os PST em doses menores (3 ou 9 mg / kg), além de ter inibido o edema osmótico, também foi capaz de inibir a infiltração de células inflamatórias, principalmente neutrófilos, como anteriormente mostrado na atividade da MPO (Figura 19).

5.4. Avaliação da toxicidade subcrônica

Estudos de toxicidade sistêmica são definidos a partir da redução na massa corpórea dos animais experimentais (TOFOVIC; JACKSON, 1999; RAZA et al., 2002; TEO et al., 2002). Além da redução do desenvolvimento ponderal, a toxicidade sistêmica se manifesta através da redução nos consumos de água e ração, alterações de comportamento, apatia e má condição da pelagem, como a presença de pêlos arrepiados (MELLO, 2001). Outros sinais de toxicidade podem se expressar pela alteração da massa relativa dos órgãos, alterações hematológicas e bioquímicas sangüíneas (GONZALEZ; SILVA, 2003).

Neste trabalho, após a realização dos ensaios de atividades antinociceptiva e antiinflamatória, foram avaliados alguns parâmetros de toxicidade utilizando camundongos (machos) tratados com PST de G. cornea na dose de 9 mg kg-1 (i.p.).

Durante um período de 14 dias consecutivos, não se verificou mortalidade dos animais, ou qualquer tipo de alterações físicas ou comportamentais e os mesmos mostraram-se saudáveis visualmente ao longo do período avaliado. De acordo com a tabela 2, a massa corpórea dos animais tratados com os PST de G. cornea não diferiu em comparação aos grupos controles salina (p>0,05) e com relação ao peso dos órgãos, os valores encontrados demonstraram ausência de diferenças significativas em comparação ao grupo salina, sugerindo que o tratamento com PST de G. cornea não afetaram a massa relativa desses órgãos avaliados (p>0,05) (SIQUEIRA et al., 2010). Contudo, houve diferença significativa (p<0,05) do peso do baço dos camundongos em comparação com o grupo salina, possivelmente indicando uma propriedade imunomoduladora desses compostos (LINS et al., 2009).

As análises bioquímicas demonstraram que os valores obtidos para as enzimas alanina aminotransferase (TGP) e aspartato aminotransferase (TGO) e fosfatase alcalina, utilizadas como marcadores de função hepática, não se alteraram, assim como, creatinina e uréia (parâmetros de função renal) em relação ao grupo salina (p>0,05). (Tabela 3)

Tabela 3. Efeitos dos PST de G. cornea (9 mg kg-1) com relação as analíses bioquímicas das enzimas: alanina aminotransferase (TGP) , aspartato aminotransferase (TGO) , fosfatase alcalina, creatinina e uréia. Os valores representam a média ± E.P.M. de 6 animais por grupo. Teste de t- de-Student para valores não pareados. *p<0,05 comparando com o controle salina (NaCl 0,15M).

Parâmetros Tratamento (i.p.)

Salina PST-Gc (9 mg kg-1)

Uréia ( mg dL-1) 31,71 ± 2,92 31,64±1,44

Creatinina( UI L-1) 0,678 ± 0,01 0,706 ± 0,12

Fosfatase alcalina (UI/L) 104,4 ± 3,13 100,00 ± 3,51

TGO (U/L) 76,57 ± 5,49 71,47±3,62

TGP (U/L) 7,16 ± 0,71 9,65 ± 3,94

Tabela 2. Efeitos sistêmicos da administração dos PST de G. cornea (9 mg kg-1) em camundongos durante 14 dias consecutivos. Os animais foram pesados e receberam doses diárias de PST (9 mg kg-1) durante quatorze dias consecutivos. Ápos o sacrifício os órgãos foram removidos e pesados. Os valores representam a média ± E.P.M. de 6 animais por grupo. Teste de t-de- Student para valores não pareados. *p<0,05 comparando com o controle salina (NaCl 0,15M).

Parâmetros Tratamento (i.p.)

Salina PST- Gc (9 mg kg-1) Peso corporal (g) inicial 25,68 ± 0,667 26,47 ± 0,758 Peso corporal (g) final 29,75 ± 0,50 30,42 ± 1,124 Fígado (g /100g peso) 5,46±0,087 5,72±0,09 Rim (g /100g peso) 0,77 ± 0,03 0,87 ± 0,03 Coração (g/ 100g peso) 0,81 ± 0,03 0,84 ± 0,06 Baço (g 100g/ peso) 0,32 ± 0,01 0,68 ± 0,03* Timo (g 100g/ peso) 0,284 ± 0,02 0,345±0,04

Adicionalmente, foram realizadas análises histológicas dos órgãos a fim de verificar, a presença ou não, de alguma anormalidade na morfologia das células e tecidos. Para tanto, os tecidos foram fixados, cortados e corados com hematoxilina- eosina (HE) para observação de possíveis lesões em microscopia óptica. Os resultados mostraram que a estrutura histológica do fígado e baço dos animais tratados com PST de G. cornea estava dentro dos limites da normalidade quando comparados com os grupos controles salina. Não foram observadas alterações do parênquima nem do estroma destes órgãos. No entanto, foram observadas pequenas alterações morfológicas em escala microscópica tanto do rim como coração dos animais tratados com os PST comparados aos controles salina. O rim mostrou ligeira dilatação tubular e vascular, mas esses dados não indicam nefrotoxicidade, e o coração apresentou uma pequena degeneração microvesícular das fibras cardíacas. Contudo, não se constatou lesões significativas nesses órgãos, mas sim tendências de alterações histológicas reversíveis.

Figura 21. Estrutura morfológica do fígado

de animais tratados com salina.

Figura 22. Estrutura morfológica do fígado de

animais tratados com PST de G. cornea

Figura 23. Estrutura morfológica do baço de

animais tratados com salina.

Figura 24. Estrutura morfológica do baço de

Figura 27. Estrutura morfológica do rim de

animais tratados com salina.

Figura 25. Estrutura morfológica do coração de

animais tratados com salina.

Figura 28. Estrutura morfológica do baço de

animais tratados com PST de G. cornea.

Figura 26. Estrutura morfológica do coração de

Além dessas investigações, o nosso estudo também avaliou alguns parâmetros hematológicos do sangue e os resultados estão apresentados na tabela 4. Os resultados mostram que todos os parâmetros avaliados foram considerados normais em comparação com os controles salina, principalmente quando considerados o equilíbrio osmótico, além da preservação do número de células de defesa (SIQUEIRA et al., 2010). Exceção feita apenas à hemoglobina, que ocorreu uma ligeira redução (p<0,05).

Tabela 4. Parâmetros hematológicos de camundongos tratados com PST de G.

cornea durante 14 dias consecutivos. Os valores representam a média ±

e.p.m. de 6 animais por grupo. Teste de t-Student para valores não pareados. *p<0,05 diferença significativa com o grupo salina.

Parâmetros Tratamento (i.p.)

Salina PST(9 mg kg-1) Hemácias (106 µL-1) 8,86 ± 0,18 8,27±0,35 Hemoglobina (g dL-1) 14,25 ± 0,29 12,85±0,46* Hematócrito(%) 45,78 ± 1,27 41,65±1,55 VCM (fL) 50,62 ± 0,33 50,40±0,49 HCM(pg) 15,92 ± 0,11 15,57±0,19 CHCM (g dL-1) 25,92 ± 0,32 30,85±0,13 Leucócitos (103 µL-1) 4,16 ± 0,52 2,58±0,31 Linfócitos 3,66± 0,41 2,18±0,31 Monócitos 0,00 ± 0,00 0,00±0,00 Neutrófilos 0,45± 0,10 0,40±0,05 Plaquetas (103 µL-1) 977,4± 51,85 921,50±131,10

Segundo Assreuy et al. (2008), o tratamento sistêmico (48 h) de camundongos com um PS (30 mg kg-1; i.v.) da alga marinha vermelha C. feldmannii não resulta em sinais de toxicidade importantes. Assim como a utilização de um PS isolado da alga marinha parda L. variegata para o tratamento (1mg kg-1; i.v.) de camundongos durante sete dias consecutivos (SIQUEIRA et al., 2010).

Diante dos resultados bioquímicos, histológicos e hematológicos encontrados, podemos assim sugerir que a administração, no decorrer de 14 dias consecutivos, dos PST de G. cornea não resulta em toxicidade sistêmica importante, mostrando-se viável como possíveis compostos com propriedades antinociceptivas e antiinflamatórias.