The wave-induced circulation

Cultivada com Dendezeiros

Neste trabalho, um grande número de sequências, quase 600 mil para as duas amostras, foram obtidas no pirosequenciamento, e, segundo a cobertura de Good, foram suficientes para cobrir a diversidade de Archaea. As comunidades de arqueias perfazem de 1 a 5% das comunidades microbianas presentes das camadas superiores dos solos (ROESCH et al., 2007; BATES et al., 2011). Entretanto, os índices de riqueza, Chao1 e ACE, estimam um número de OTUs para as duas amostras bem superior ao encontrado. Deve-se ter em consideração se tratar de um domínio pouco conhecido e, apesar de terem sido utilizados

primers desenhados recentemente a partir de um grande número de sequências de 16S rRNA

do banco de dados SILVA, dificilmente será possível englobar toda a diversidade de arqueias (BAKER, SMITH; COWAN, 2003).

A cobertura de Good e curvas de rarefação mostram que uma melhor cobertura da diversidade foi obtida pela área cultivada com dendezeiros, em comparação com a mata nativa. Os índices de diversidade, Simpson Invertido e Shannon, mostram maior diversidade para a amostra de mata nativa, assim como os índices de riqueza, Chao1 e ACE. Estes resultados são consistentes com estudos comparativos entre comunidades de arqueias de solos de floresta e cultivados, onde maiores teores de matéria orgânica foram relacionados com uma maior diversidade (TAKETANI; TSAI, 2010). O solo de mata nativa possui maiores teores de matéria orgânica e carbono total em relação à área cultivada com dendezeiros. O diagrama de Venn também mostra uma maior riqueza da mata nativa, quando comparada com a área cultivada com dendezeiros. Entretanto, metade das OTUs da área cultivada com dendezeiros é compartilhada com a mata nativa; o que mostra que a área cultivada possui cerca da metade de sua comunidade com a mesma composição da comunidade de arqueias que a mata nativa, mas com menor diversidade, em riqueza e abundância.

Foram encontrados maiores teores de fósforo e potássio nas amostras de solo da área cultivada com dendezeiros, o que provavelmente deve-se à fertilização. Em um estudo sobre os impactos da fertilização dos solos sobre as comunidades bacterianas e de arqueias, usando PCR em tempo real, foi observada influência do pH sobre a abundância de arqueias do filo Crenarchaeota (Thaumarchaeota I.1c após reanálise pelo banco de dados SILVA 119),

relacionando variações de pH com mudanças na diversidade das comunidades de arqueias (WESSÉN, HALLIN; PHILIPPOT, 2010). Entretanto, foram utilizados primers para o domínio Archaea (A364aF/A934b e 771F/957R) que só foram capazes de identificar 43 e 53% das 54.717 sequências de arqueias depositadas no banco de dados RDPII na ocasião do estudo, respectivamente, levando a uma clara subestimação da diversidade de arqueias nos solos estudados. Todavia, em uma análise de 27 amostras de solos tropicais coletados pela área central e sul da península Malaia e norte de Bornéu, usando primers específicos para arqueias (Arch-967F/Arch-1060R), pirosequenciamento e PCR em tempo real, o pH também foi o melhor preditor da composição da comunidade e diversidade de Archaea, com aumento da riqueza e abundância das comunidades de arqueias com a acidificação dos solos (TRIPATHI et al., 2013).

Uma comparação entre solos de Terra Preta Antropogênica Amazônica sob diversos tipos de cultivo (berinjela, banana, citrus e mandioca) e usos (pasto e floresta secundária) também encontraram possíveis efeitos sobre a diversidade dessas comunidades, especialmente associados com variações de pH, teores de enxofre e matéria orgânica por fertilização e também pelo tipo de solo; pH, cálcio e carvão foram os principais fatores de diferenciação entre o solo antropogênico e os solos adjacentes (TAKETANI; TSAI, 2010).

O uso da terra também pode ter impacto sobre as comunidades de arqueias do solo. Em um estudo dos impactos do uso da terra e diferentes cultivos (pasto natural, floresta nativa, plantações de Eucalyptus, Acacia, soja e melancia) sobre as comunidades fúngicas e de arqueias de solos do Pampas brasileiros usando RISA (Ribossomal rRNA Intergenic

Spacer Analysis), observou-se que não apenas o uso da terra, mas também o tipo de solo pode

gerar mudanças nessas comunidades, com maior impacto do primeiro (LUPATINI et al., 2013).

Nas amostras de mata nativa e área cultivada com dendezeiros, todas as OTUs encontradas foram classificadas no domínio Archaea, o que confirma a especificidade dos

primers usados. Apenas dois filos, Euryarchaeota e Thaumarchaeota, foram encontrados,

sendo o filo Thaumarchaeota majoritário na mata nativa. Essa predominância do filo Thaumarchaeota em solos de mata foi observada em outros tipos de solos (TRIPATHI et al., 2013), além disso, a baixa representação do filo Euryarchaeota é característica de solos de floresta (KEMNITZ, KOLB; CONRAD, 2007).

Um estudo metagenômico comparativo das comunidades de arqueias dos solos da Floresta Atlântica e da Caatinga usando pirosequenciamento encontrou predominantemente representantes do filo Thaumarchaeota (unclassifieds) em solos de Caatinga, assim como

representantes dos filos Euryarchaeota (Halobacteria) e Crenarchaeota (Thermoprotei) nas duas amostras, mas com baixa ocorrência (PACCHIONI et al., 2014). Resultados semelhantes foram obtidos em solos do Cerrado, usando primers específicos para arqueias e amplificação do gene 16S rRNA, onde foram comparadas as comunidades de arqueias em solos de cerrado denso e mata de galeria. As 243 sequências obtidas pertencem ao filo Thaumarchaeota (CATÃO et al., 2013).

Em uma análise do impacto do uso da terra (sistema de cultivo indígena e pasto) sobre as comunidades de arqueias, usando diferentes tipos de solos amazônicos por DGGE e amplificação do gene amoA, foram observadas mudanças na estrutura das comunidades de arqueias quando comparadas as áreas cultivadas com as florestas convertidas em pasto. Neste estudo, usando DGGE, foram encontradas arqueias pertencentes aos filos Euryarchaeota e Crenarchaeota (Thaumarchaeota na classificação atualizada a partir do banco de dados SILVA 119); entretanto, apenas 9 sequências foram recuperadas das bandas excisadas do gel. A partir da amplificação e sequenciamento do gene amoA foram obtidas 306 sequências classificadas como AOAs pertencentes ao filo Thaumarchaeota (NAVARRETE et al., 2011).

Devido à taxonomia em desenvolvimento das arqueias, o trabalho de Navarrete e colaboradores não considerou o novo filo Thaumarchaeota; proposto por Brochied-Armanet e colaboradores (BROCHIER-ARMANET et al., 2008). Entretanto, uma reanálise atual dos seus dados usando o banco de dados SILVA 119 mostra que duas sequências obtidas por DGGE são na verdade pertencentes ao filo Thaumarchaeota.

É importante mencionar que diversos estudos atuais sobre arqueias ainda não consideram o filo Thaumarchaeota. Este filo foi proposto após um estudo onde dois genomas de AOAs marinhas foram comparados e um grupo de genes específicos deste grupo foi encontrado (SPANG et al., 2010). Para fins de discussão, os dados dos trabalhos científicos aqui citados foram reanalisados, atualizando a classificação taxonômica com o banco de dados SILVA 119 para considerar o filo Thaumarchaeota, sempre que possível.

Outro trabalho sobre a influência do uso do solo sobre a estrutura das comunidades de arqueias em solos antropogênicos amazônicos usando análise do 16S rRNA e genes amoA também encontrou representantes do filo Thaumarchaeota (TAKETANI; TSAI, 2010). Este trabalho usou a ferramenta de classificação do GreenGenes e a chave taxonômica do National

Center for Biotechnology Information – NCBI; a classificação foi reanalisada usando o banco

Sendo assim, este trabalho confirma estudos prévios que mostram uma alteração entre as proporções dos filos Euryarchaeota e Thaumarchaeota em solos de floresta convertidos em pasto.

O filo Thaumarchaeota possui várias AOAs e está diretamente envolvido no metabolismo do nitrogênio. O grupo I.1a usa a energia da oxidação da amônia predominantemente em sistemas aquáticos (SPANG et al., 2010) e o grupo I.1b em solos (PESTER et al., 2012). O grupo I.1c é amplamente encontrado em solos ácidos, mas sua função ecológica ainda é desconhecida (HE, HU; ZHANG, 2012; ZHANG et al., 2012).

No estudo das comunidades de arqueias em solos do Cerrado foram encontrados especialmente no cerrado denso representantes do grupo I.1b e, na mata de galeria, dos grupos I.1a e I.1c (CATÃO et al., 2013). Nas amostras de mata nativa e área cultivada com dendezeiros foram encontradas OTUs pertencentes aos grupos I.1a (Ca. Nitrosotalea) e I.1b (Ca. Nitrososphaera). As amostras de solo do Cerrado também são ácidas (pH entre 4,5 e 5), assim como as amostras dos solos da mata nativa e área cultivada com dendezeiros.

Observando a árvore filogenética, as OTUs não classificadas do filo Thaumarchaeota (unclassified Thaumarchaeota), agruparam-se com arqueias pertencentes à classe Miscellaneous Crenarchaeotic Group. É possível perceber que essas OTUs não classificadas pertencentes ao filo Thaumarchaeota de ambas amostras são diferentes entre si; formando vários pequenos clusters, todos relacionados com a classe Miscellaneous Crenarchaeotic Group, um grupo de arqueias amplamente encontradas em solos, água doce e sedimentos marinhos (LI et al., 2012). Essas OTUs representam 6% de todas as OTUs da mata nativa e 5% de todas as OTUs da área cultivada com dendezeiros. Entretanto, esses dados devem ser analisados com cautela. Deve-se ressaltar as limitações de um estudo baseado em 16S rRNA; o nível de variação entre as sequências de do gene 16S rRNA é pequeno para que possam ser feitas classificações em nível de espécie, por exemplo. No estudo de Lehtovirta-Morley e colaboradores (2014), duas AOAs acidófilas: Nitrosotalea devanaterra Nd1 e Nitrosotalea sp., isoladas a partir de um arrozal chinês e solo agrícola escocês, se apresentaram muito semelhantes em uma classificação filogenética dos genes 16S rRNA e amoA; entretanto, suas fisiologias são extremamente diferentes em fatores como temperatura ótima de crescimento, resposta à ácidos graxos e velocidade de crescimento. O uso de primers mais específicos possibilitará um estudo mais detalhado dessas OTUs, como, por exemplo, primers que amplifiquem a região ITS, para uma classificação em nível de espécie, além do uso de genes funcionais.

Em um trabalho sobre os padrões ecológicos globais de arqueias por meio do estudo dos genes 16S rRNA existentes em bancos de dados (com habitats incluindo solos, água, sedimentos de rios, fontes hipersalinas, fontes termais, água do mar e sedimento marinho) encontrou-se uma estrutura filogenética padrão em todas as comunidades de arqueias, com filotipos próximos, ao invés de linhagens diversas (AUGUET, BARBERAN; CASAMAYOR, 2010). No solo, os principais grupos de arqueias encontrados foram os grupos I.1b e I.1c do filo Thaumarchaeota. Neste trabalho, estes grupos foram classificados usando o banco de dados do GenBank como arqueias mesofílicas do filo Crenarchaeota (DELONG, 1998); os dados foram reanalisados usando o banco de dados SILVA 119.

Esta estrutura filogenética padrão encontrada em solos é consistente com diversos trabalhos científicos, inclusive este, com representação dos grupos I.1a, I.1b e I.1c, com predominância do último em solos ácidos (JURGENS, LINDSTROM; SAANO, 1997b; LEHTOVIRTA, PROSSER; NICOL, 2009; AUGUET, BARBERAN; CASAMAYOR, 2010; YARWOOD, BOTTOMLEY; MYROLD, 2010).

Um estudo sobre o impacto da conversão de floresta nativa em pasto mostrou que o uso da terra nos solos Amazônicos não altera apenas a composição e abundância das comunidades microbianas, mas também a sua diversidade de genes funcionais (PAULA et al., 2014).

Este trabalho encontrou uma predominância do filo Thaumarchaeota na amostra de mata nativa, especialmente da classe Soil Crenarchaeotic Group (SCG), com diferenças significativas em abundância, em comparação com a área cultivada com dendezeiros. Esta classe foi descoberta em solos de floresta boreal (JURGENS, LINDSTROM; SAANO, 1997a). Ca. Nitrososphaera pertence a essa classe. É uma AOA envolvida no metabolismo do nitrogênio, usando amônia ou ureia como fonte de energia, e é um membro do grupo I.1b do filo Thaumarchaeota (TOURNA et al., 2011; ZHALNINA et al., 2014). Este gênero candidato possui uma representatividade superior nos solos de mata nativa, em comparação com a área cultivada com dendezeiros. Em um estudo comparativo das comunidades de arqueias de solos antropogênicos e adjacentes, este foi um dos gêneros mais abundantes (TAKETANI; TSAI, 2010).

Entretanto, Ca. Nitrosotalea, outra AOA, apresentou uma abundância significativamente superior na área cultivada com dendezeiros, em comparação com a mata nativa. Candidatus Nitrosotalea devanaterra, uma AOA acidófila obrigatória, foi cultivada a partir de solos ácidos nitrificantes (LEHTOVIRTA-MORLEY et al., 2011). Posteriormente, o

mesmo grupo caracterizou duas cepas de AOAs pertencentes ao mesmo gênero a partir de um arrozal chinês e solo agrícola escocês (LEHTOVIRTA-MORLEY et al., 2014).

A maior abundância destes gêneros candidatos (Ca. Nitrososphaera e Ca. Nitrosotalea) nas amostras pode ter relação com o pH baixo dos solos. O pH possui influência sobre a atividade de AOAs, já que em solos básicos o crescimento e atividade dessas arqueias são reduzidos devido à queda exponencial da disponibilidade de nitrito (FRIJLINK et al., 1992; NICOL et al., 2008). Em um estudo da estrutura e composição de arqueias e bactérias oxidadoras de amônia (AOA e AOB) de solos após a conversão de uma plantação de soja em arroz no norte da China, por meio de DGGE e quantificação dos genes amoA de bactérias e arqueias com PCR em tempo real, tanto a estrutura quanto a abundância dessas comunidades foram afetadas, especialmente pelos teores de amônia, nitratos/nitritos, disponibilidade de oxigênio e variações de pH (WANG, WANG; GU, 2014).

Se torna claro que as AOAs possuem um papel importante dentro das comunidades de arqueias estudadas neste trabalho, especialmente na mata nativa, onde são mais abundantes.

Neste estudo, o segundo filo encontrado foi o Euryarchaeota, mais abundante nos solos da área cultivada com dendezeiros. Este filo tem um papel direto no ciclo do carbono, com várias classes de arqueias metanogênicas ou oxidadoras de metano (GALAGAN et al., 2002; ANDERSON et al., 2009; WREDE et al., 2013).

Neste filo, Methanomicrobia e Thermoplasmata foram as principais classes encontradas, além de algumas OTUs classificadas nas classes Methanobacteria e Halobacteria. As classes Methanobacteria e Methanomicrobia são metanogênicas (GARRITY, 2001). A classe Methanomicrobia está representada nas duas amostras com maior representação na área cultivada com dendezeiros, em comparação com a mata nativa. Nesta classe, os gêneros Rice Cluster I, Methanosarcina e Methanocella estão presentes nas duas amostras. Estes gêneros são próximos e amplamente encontrados em campos de arroz, produzindo metano (SAKAI et al., 2011). Um estudo sobre as comunidades de arqueias em campos de cultivo de arroz demostrou o impacto positivo da adubação com nitrogênio sobre a abundância desses gêneros (IKEDA et al., 2014).

A área cultivada com dendezeiros sofre com alagamentos recorrentes. Além disso, a coleta foi feita em época de chuvas, onde a oxigenação do solo é reduzida, favorecendo a ação de arqueias metanogênicas, o que pode levar a um aumento na abundância dessas arqueias.

Observou-se a presença de arqueias halófilas (Halobacteria) nas duas amostras, mas com maior representação na área cultivada com dendezeiros. Apenas nesta amostra foi possível uma classificação até o nível de gênero, com o representante Candidatus

lainarchaeum. Os classificados em nível de família foram Deep Sea Hydrothermal Vent Gp 6 e Miscellaneous Euryarchaeotic Group. Todos apresentaram pequena representação, com a maior das OTUs classificadas como unclassified Halobacteriales. Apesar de não terem sido observadas diferenças significativas dos percentuais de participação dessas OTUs entre as duas amostras, deve-se ressaltar que também foi observada a presença dessa classe de arqueias em outros tipos de solos estudados, como em solo de Caatinga e mata Atlântica (PACCHIONI et al., 2014). Em um estudo sobre o impacto da estratificação dos solos de uma plantação de abeto (Picea abies) sobre as comunidades microbianas foi possível observar um aumento na representatividade de Halobacterias da parcela do solo mineral para o orgânico (UROZ et al., 2013). Ou seja, assim como neste estudo, com a queda do teor de matéria orgânica no solo houve aumento da representatividade de Halobacterias no solo. Apesar da ordem Halobacteriales ser encontrada em diversos tipos de solos, sua representatividade é baixa, sendo uma ordem com alta tolerância à sal, comumente encontrada em ambientes altamente salinos (QIAN et al., 2011). Entretanto, já foram isoladas arqueias halófilas que conseguem sobreviver em concentrações de NaCl semelhantes àquelas encontradas na água do mar, mostrando uma grande versatilidade fisiológica por parte dessas arqueias (ELSHAHED et al., 2004; PURDY et al., 2004; SAVAGE et al., 2007).

A maioria das OTUs classificadas em nível de gênero encontradas nesse estudo pertencem ao filo Euryarchaeota; apenas três possuem diferenças significativas entre as amostras. Rice Cluster I possui a maior representação, sendo mais abundante na mata nativa; seguido pelos gêneros Methanocella e Methanosarcina, ambos envolvidos na metanogênese e ligeiramente mais abundantes na área cultivada com dendezeiros.

Após a análise dos dados deste trabalho, torna-se clara a possibilidade de que metanogênese ocorra nos dois solos estudados, com mais intensidade na área cultivada com dendezeiros, a qual apresentou maior abundância de arqueias pertencentes a gêneros metanogênicos. Entretanto, mais estudos são necessários para elucidar-se os papéis biológicos das arqueias nestes solos.

O uso dos solos pode ser relacionado com as funções metabólicas das suas comunidades microbianas. Plantações de dendezeiro (Elaeis guineensis Jacq.) foram implementadas na região Amazônica, principalmente pela agricultura familiar e para recuperação de áreas degradadas (BRASIL). Esta cultura possui boa capacidade de armazenamento de carbono no solo, representando uma cultura potencialmente autossustentável, especialmente sob o sistema Agroflorestal (DE CARVALHO et al., 2014). Entretanto, essa cultura precisa de nutrientes e é normalmente cultivada em solos pobres,

demandando altos níveis de fertilizantes para alcançar boa produtividade (SHAMSHUDDIN; DAUD, 2011).

Uma monocultura também é um fator que pode impactar a composição das comunidades microbianas. Em um estudo dos efeitos do uso da terra sobre os microrganismos fixadores de nitrogênio na floresta Amazônica usando a análise do gene nifH, que codifica uma das subunidades da enzima nitrogenase, observou-se que as comunidades de plantas, em particular suas demandas por nitrogênio, afetam esses microrganismos (MIRZA et al., 2014).

Estudos mostram uma relação direta entre mudanças da vegetação e queda da biomassa microbiana (CENCIANI et al., 2009), além de aumento na biomassa relacionado a teores aumentados de matéria orgânica no solo (VINHAL-FREITAS et al., 2010). Por outro lado, em um trabalho sobre as comunidades microbianas em solos amazônicos sob diversos tipos de cobertura vegetal, encontrou-se uma atividade microbiana aumentada em solos cultivados ou pasto, em comparação com a floresta nativa (SILVA, DE ARAUJO NETO; KUSDRA, 2014); o que pode ser devido a um acréscimo regular de nutrientes nestes solos por adubação (HAN et al., 2007). Sendo a fertilidade dos solos amazônicos dependente da deposição de matéria orgânica proveniente dos restos vegetais das florestas, ações antrópicas, como o desmatamento, impactam diretamente sobre as comunidades microbianas (MATSUOKA, MENDES; LOUREIRO, 2003).

Pode-se então observar que, assim como nas comunidades bacterianas, ocorreram alterações na comunidade de arqueias dos solos estudados; todavia, diferentemente dos estudos sobre bactérias dos solos, ainda há pouco a ser dito sobre as comunidades de arqueias destes solos, já que se trata de um domínio novo, ainda pouco estudado. O cultivo dessas arqueias é um passo importante para se desvendar seus papéis biológicos em seus habitats.

Neste trabalho foram analisadas as comunidades de arqueias de solo amazônico nativo e cultivado com dendezeiros. As comunidades de bactérias e fungos nesses solos também estão sendo abordadas em outros trabalhos.

As comunidades de arqueias dos solos amazônicos estudados pertencem a dois filos, Thaumarchaeota e Euryarchaeota, com predominância do primeiro nos solos de mata nativa, semelhante ao que foi relatado para outros tipos de solos brasileiros como Caatinga, Cerrado e outros solos da Amazônia (pastagens e solos agrícolas).

Ao comparar-se as comunidades de arqueias de solos da mata nativa e de uma área adjacente cultivada com dendezeiros encontrou-se uma correlação direta entre os níveis de matéria orgânica, carbono total e fósforo e a diversidade de arqueias. Observou-se também um efeito inverso do uso da terra sobre a diversidade dessas comunidades. A presença de

gêneros envolvidos no metabolismo de carbono e nitrogênio (Methanocella e Methanosarcina – metanogênicas; Ca. Nitrososphaera e Ca. Nitrosotalea - AOAs) provê uma pista sobre os possíveis papéis das comunidades de arqueias em solos da Amazônia; entretanto, são necessários estudos mais direcionados nesse sentido, como por meio do sequenciamento do genoma de arqueias em busca da caracterização de seus genes funcionais, amplificação via PCR de genes funcionais, como o amoA, para o estudo das comunidades de AOA, ou ainda, determinação da abundância dessas comunidades por meio de PCR em tempo real utilizando

primers mais específicos para caracterização das arqueias em nível de espécie.

As políticas públicas não levam em consideração os impactos da antropização sobre as comunidades microbianas do solo. Este estudo de arqueias mostra que, de maneira similar ao que ocorre macroscopicamente, a diversidade microbiana diminui quando a mata nativa é trocada por uma monocultura. Talvez, no futuro, uma análise de custo-benefício seja feita antes de serem implementados projetos na região Amazônica e o impacto sobre a diversidade microbiana seja levado em consideração.