Alterações histológicas como vasodilatação, edema e infiltrado inflamatório foram mensuradas morfometricamente.
4.6.1Medida da espessura da pele
A espessura da pele foi mensurada a fim de se quantificar o edema observado histopatologicamente. Para tanto, lâminas de fragmentos de pele foram digitalizadas em microscópio estereoscópico em objetiva de 4x e telemétrica de 3.3, que resultou em um aumento final de 12x. A calibração, em milímetros, no programa Image Pro-plus foi feita digitalizando-se uma régua milimetrada. A mensuração dos fragmentos foi adaptada de Chorili et al. (2007). A medida da espessura da pele foi obtida através da distância entre a epiderme e a camada muscular. As medidas foram feitas em três pontos aleatórios de cada fragmento de pele.
4.6.2 Medida de vasos sanguíneos
A quantificação da vasodilatação foi feita medindo-se o diâmetro médio dos vasos sanguíneos, de secções de pele coradas em HE tanto dos animais tratados quanto dos controles. As imagens foram capturadas utilizando o microscópio Olympus BX-640 e digitalizadas através de uma câmera JVC TK-1270/JGB no aumento de 10x. As imagens foram transferidas para um analisador de imagens (Kontron Electronic, Carl Zeiss – KS300, versão 2), onde foram obtidas as medidas de diâmetro médio dos vasos em micrômetros. Foram utilizados 10 campos por animal tanto do grupo controle quanto do grupo tratado, totalizando 50 campos por intervalo de tempo (2, 4, 6 e 8 horas) já que o “n” era de 5 animais por grupo.
4.6.3 Infiltrado Inflamatório
Para mensurar o infiltrado inflamatório, calculou-se o número mínimo de campos representativos microscópicos por amostra que foi determinado a partir de uma única lâmina na qual foi analisado e registrado o número de células inflamatórias por campo de acordo com Moro et al. (2003). As imagens foram capturadas utilizando-se a objetiva de 40x e secções coradas em HE. Foram calculados a média e os respectivos erros padrões e coeficientes de variação. O tamanho amostral considerado como número mínimo representativo foi de 25 campos, definido como aquele em que o acréscimo do nº de campos não resultou em redução considerável no valor do erro ou coeficiente de variação (Sampaio, 1998) (Gráf. 2).
GRÁFICO 2: Número mínimo de campos representativos para a quantificação das células inflamatórias.
4.7 Marcação de heterófilos através da reação de imunoistoquímica
Os cortes de 5 µm, em lâminas previamente tratadas com solução de organosilano a 2%, foram desparafinados e hidratados pela passagem em xilol I e II, duas vezes por cinco minutos cada. Posteriormente passaram por um processo de hidratação nos álcoois 100%, 95%, 70%, cinco minutos cada. Em seguida os cortes foram tratados com solução de protease (0.5 U/mL durante 4 minutos). Os cortes foram incubados com anticorpo monoclonal de camundongo anti-humano para calprotectina à numa concentração de 1:250 à 37ºC. A antígeno/anticorpo foi visualizada utilizando o kit universal de detecção de fosfatase alcalina “red” de
acordo com as instruções do fabricante. A contra-coloração foi feita com solução de hematoxilina de Harris (FALEIROS et al., 2009).
4.8 Identificação in situ da fragmentação do DNA segundo a técnica de TUNEL (Marcação in situ da fragmentação do genoma com transferase terminal de deoxinucleotídeo)
A técnica foi realizada segundo GAVRIELI et al. (1992). Foi seguido o protocolo especificado pelo fabricante. O tempo de proteinase K era de 15 minutos a uma concentração de 2 mg/ml. As lâminas eram lavadas em salina tamponada TRIS – TBS 1X. Em seguida, a peroxidase endógena era inativada, cobrindo-se as secções com água oxigenada a 3% em metanol, por 5 minutos. As lâminas eram novamente lavadas em TBS 1X (20 mM de Tris pH 6, 140 mM de NaCl) e, logo após as secções eram cobertas com tampão de equilíbrio por cerca de 10 a 30 minutos, à temperatura ambiente. A secção era então coberta com a enzima TdT (transferase terminal de deoxinucleotídeo) e deoxinucleotídeos. As lâminas eram colocadas em câmara úmida a 37 C por 1,5 h. Posteriormente, as lâminas eram lavadas em TBS 1X e cobertas com tampão de parada (0,5M de EDTA, pH 8), onde permaneciam por 5 minutos. As secções eram lavadas em TBS 1X e, logo após, cobertas com o tampão de bloqueio e incubadas por 10 minutos. Os cortes foram então tratados com um conjugado de peroxidase strepto-avidina diluído em tampão de bloqueio. A incubação era feita em câmara umidificada por 30 minutos, à temperatura ambiente. As lâminas eram lavadas em TBS 1X e as secções cobertas com diaminobenzidina – DAB por 10-15 minutos, à temperatura ambiente. Posteriormente, as lâminas eram lavadas em água destilada e contra-coradas com 0,3% de verde de metila por 10 minutos, à temperatura ambiente. O excesso de corante era absorvido com toalha de papel e as lâminas eram imersas 2-4 vezes em etanol absoluto. Em seguida, repetiu-se esta etapa com etanol absoluto fresco. As lâminas eram então imersas em xilol e montadas.
Além da marcação específica (grumos amarronzados, revelados pela DAB), foram consideradas características morfológicas de apoptose o enrugamento celular com projeções digitiformes da membrana e formação de corpos apoptóticos
e fragmentação da membrana nuclear e a compactação da cromatina em massas densas uniformes alinhadas no lado interno da membrana nuclear.
4.9 Reações de imunoistoquímica para Bax
Secções de pele de coelho eram desparafinadas em estufa a 58ºC e posteriormente submersas em Xilol I e II por 20 minutos. Posteriormente as lâminas eram mergulhadas 10 vezes em cada um dos álcoois: absoluto I e II, 90%, 80%, 70% e lavadas em solução salina de TBS por 5 minutos. Em seguida era realizada a recuperação antigênica com solução de tampão citrato pH 6,0 por 20 minutos em banho-maria à temperatura de 93ºC. Após atingirem a temperatura ambiente, as lâminas eram lavadas em água destilada. Posteriormente, era realizado o bloqueio da peroxidase endógena pingando-se uma gota do reagente peroxidase block sobre os cortes e incubando-se por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida as secções de pele eram lavadas em água destilada e em solução tampão de lavagem por 5 minutos à 25º C e os cortes eram secos, cobertos e incubados com o anticorpo primário por 12 horas em câmara úmida a 25º C. Posteriormente, eram feitas duas lavagens em solução tampão por 5 minutos cada, as secções eram secas ao redor e o complexo estreptavidina–peroxidase era aplicado e incubado em câmara úmida por 30 minutos à 25º C. Em seguida, as secções eram lavadas duas vezes em tampão e secas ao redor e aplicava-se o DAB (diaminobenzidina) sobre os mesmos e incubava-se por 5 minutos à temperatura ambiente. As lâminas eram então lavadas em água corrente e destilada e contra- coradas com hematoxilina, seguida de uma lavagem em água amoniacal a 1%. Finalmente, as lâminas eram desidratadas e montadas permanentemente. O anticorpo primário utilizados foi: anticorpo monoclonal produzido em camundongo para Bax clone 2D2 (Invitrogen). O kit utilizado foi o Dako ARK (Animal Research
4.10 Análises estatísticas
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão ou mediana, conforme tenham apresentado uma distribuição normal ou não, pelo teste de
Kolmogorov-Smirnov. Quando a distribuição era normal utilizou-se a análise de
variância (ANOVA) para avaliar eventuais diferenças entre os parâmetros mensurados nos diferentes tempos de injeção do veneno em relação aos grupos controles e aplicou-se o teste de Newnam Keuls para comparar os grupos entre si. Quando a distribuição dos dados não demonstrava normalidade, o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foi aplicado e o pós-teste de Dunn’s utilizado para
múltipla comparação. Os valores de P<0,05 foram considerados significativos. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa GraphPad Prism versão 5.
5 RESULTADOS
5.1 Estudos in vivo em coelhos 5.1.1 Análise Macroscópica
Macroscopicamente foi possível observar na pele dos coelhos injetados com 50 µL (0,5 µg) de veneno de Loxosceles similis, uma lesão que se difundiu radialmente com o passar do tempo. Além disso, a área onde o veneno foi injetado ficou arroxeada, edemaciada e sensível ao toque (FIG. 2) em todos os intervalos de tempo. A injeção de 0,5 µg de veneno bruto foi o suficiente para atingir a musculatura (FIG. 13).
FIGURA 13 -Pele de coelho: (A) Grupo controle- notar o local da injeção de 50 µL de PBS (seta branca), (B) Grupo tratado –notar a área arroxeada tanto no local de injeção (seta preta) quanto radialmente (seta preta), 2 horas após a injeção de 0,5 µg de veneno bruto de L. similis, (C) Grupo tratado 8 horas após a injeção de 0,5 µg de veneno bruto de L. similis, observe como o veneno (ver local de injeção- seta branca)se difunde radialmente (setas pretas) por uma área maior; (D) Grupo tratado 8
após a injeção de 0,5 µg de veneno bruto de L. similis, observe o edema (seta branca) e a hemorragia (seta preta) presentes na hipoderme. Barra = 1 cm.
5.1.2 Análises Microscópicas
Nos fragmentos de pele de coelho injetados com 0,5 µg de veneno de L.
similis nos intervalos de tempo 2, 4, 6 e 8 horas observou-se dissociação de fibras
e células em todas as camadas dérmicas (superficial, média e profunda) caracterizando edema (FIG. 14). Adicionalmente, na pele dos animais tratados havia angiectasia, hiperemia e hemorragia (FIG.15), constatou-se também a presença de trombos ocludentes e semiocludentes nos plexos superficial, médio e profundo (FIG. 16). Pôde-se também observar deposição de fibrina (Fig. 17). Em todos os intervalos de tempo, a derme apresentou infiltrado inflamatório principalmente heterofílico, particularmente nas dermes média e profunda, cuja intensidade aumentou segundo o intervalo de tempo de injeção (FIG. 18). Tal infiltrado se disseminava pela camada muscular, sendo acompanhado de necrose da musculatura, a qual era evidenciada após 6 horas de injeção (FIG. 19). Quanto à distribuição, o infiltrado era difuso em todas as camadas dérmicas, apresentando- se nodular em alguns pontos, quando o intervalo de injeção era superior a 6 horas. Nestes casos, observava-se também a formação de manguitos perivasculares que se infiltravam pelas paredes dos vasos, caracterizando vasculite (FIG. 20). Em alguns vasos, notou-se completa destruição de suas paredes. O infiltrado inflamatório foi também observado ao redor de alguns folículos pilosos e músculos eretores dos pêlos. Após 6 horas de injeção notou-se presença de degeneração fibrinóide em algumas paredes vasculares e degeneração hialina de fibras colágenas. O processo inflamatório foi caracterizado como dermatite aguda multifocal fibrinohemorrágica.
FIGURA 14 - Pele de coelho: (A) grupo controle - seta preta indicando integridade das fibras colágenas; grupo tratado (B) 2h, (C) 4h, (D) 6h e 8 h (E) após a injeção de 0,5 µg de veneno de Loxosceles similis – observar a dissociação de fibras e células caracterizando o edema (setas pretas); Coloração: HE; Barra=10 µm.
FIGURA 15 - Pele de coelho: (A) grupo controle - seta preta indicando vaso normal; (B) grupo tratado- setas indicando angiectasia, (C) hiperemia (seta) e (D) hemorragia (seta); Coloração Azul de Toluidina; Barra=10 µm.
FIGURA 16 - Pele de coelho. (A) Grupo controle- vaso sanguíneo sem trombo (seta preta); Grupo tratado- vasos sanguíneos contendo trombos oclusivos em todos os intervalos de tempo: (B) 2 h, (C) 4 h, (D) 6 h e (E) 8 horas após a injeção de 0,5 µg de Loxosceles similis (setas pretas); (F) trombo semi-ocludente 2 horas após injeção do veneno (seta azul). Coloração HE, Barra=10 µm.
FIGURA 17 - Pele de coelho (A) grupo controle - derme preservada, ausência de fibrina; Setas indicando deposição de fibrina em intervalos de 2 h (B), 4 h (C), 6 h (D) e 8 h (E) após a injeção. Inclusão em metacrilato e coloração em azul de toluidina; Barra=10 µm.
FIGURA 18 - Pele de coelho: (A) grupo controle - ausência de infiltrado inflamatório entre as fibras colágenas; grupo tratado - infiltrado inflamatório predominantemente heterofílico (setas azuis) nos diferentes intervalos de tempo: (B) 2 h, (C) 4 h, (D) 6 h e (E) 8 horas após a injeção de 0,5 µg de veneno de Loxosceles similis; (F) detalhes do infiltrado inflamatório. (metacrilato, corte semi-fino (coloração HE); Barra=10 µm.
FIGURA 19- Pele de coelho: (A) Grupo controle – músculo cutâneo íntegro e ausência de infiltrado inflamatório; grupo tratado – necrose do músculo cutâneo (setas azuis) e infiltração heterofílica (setas brancas) após 2 horas (B), 4 horas (C).6 horas (D) e 8 horas (E) de injeção de 0,5 µg de veneno de Loxosceles similis. Coloração: HE; Barra=10 µm.
FIGURA 20 - Pele de coelhos: (A) infiltrado perivascular heterofílico caracterizando perivasculite (seta branca), (B) detalhe do manguito perivascular 6 horas após injeção de veneno. Coloração: HE; Barra=10 µm.
5.2 Análise morfométrica
5.2.1 Mensuração da espessura da pele
Para a avaliação e quantificação do edema provocado pela ação do veneno de L. similis em coelhos, foram medidas a espessura da pele dos coelhos (em µm) em três pontos aleatórios de cada animal que foram posteriormente comparadas com as medidas de espessura da pele do grupo controle (animais que receberam intradermicamente apenas PBS). As médias de espessura da pele dos animais injetados com veneno de L. similis foram: 4.54 ± 0.15 µm; 4.75 ± 0.21 µm; 5.08 ± 0.27 µm e 5.10 ± 0.28 para os intervalos de 2, 4, 6 e 8 horas respectivamente. Já as médias dos animais controles foram de 3.45 ± 0.12; 3.50 ± 0.20; 3.38 ± 0.17 e 2.85 ± 0.10 µm para os intervalos de 2,4, 6 e 8 horas respectivamente (GRÁF. 2). A diferença entre os grupos controles e tratados foi significativa em todos os intervalos de tempo (P<0.0001), pelos testes ANOVA e Newman-Keuls. Não houve diferença significativa entre os grupos controles e entre os grupos tratados com veneno.
GRÁFICO 3- Mensuração da espessura da pele dos coelhos (µm) para quantificação do edema. Diferença estatística significativa (P<0.0001***), entre grupos tratados e controles em todos os intervalos de tempo pelos testes ANOVA e Newman-Keuls.
5.2.2 Mensuração dos vasos sanguíneos
Para a comprovação morfométrica da angiectasia dos vasos sanguíneos foram feitas medidas do diâmetro médio dos vasos. Os dados mostraram que o diâmetro médio dos vasos sanguíneos foi de 91.91 ± 5.89 µm, 101.7 ± 8.90 µm, 109.80 ± 10.2 µm e 109.90 ± 9.42 µm para os intervalos de 2, 4, 6 e 8 horas respectivamente, dos animais injetados com veneno. Os animais controles apresentaram diâmetro médio de 50.97 ± 5.7 µm, 55.73 ± 6.4 µm, 57.61 ± 5.53 µm e 55.94 ± 5.45 µm para os intervalos de 2,4, 6 e 8 horas de injeção de PBS (Gráf. 3). A diferença entre os grupos controles e tratados foi significativa em todos os intervalos de tempo (P<0.0001) pelos testes Kruskal-Wallis e Dunn’s.
GRÁFICO 04- Mensuração do diâmetro médio dos vasos sanguíneos. Diferença estatística significativa entre os grupos tratados (T2h, T4h, T6h e T8h) e controles, pelo teste Kruskal-Wallis, ***P<0,001.
5.2.3 Quantificação do infiltrado inflamatório e análise estatística
A morfometria do infiltrado inflamatório mostrou médias de 28,61 ± 1,79 (2h), 50,12 ± 1,63 (4h), 64,75 ± 1,82 (6h) e 105,2 ±1,53 (8h) após a injeção do veneno de L. similis. Já os animais controles apresentaram nos respectivos intervalos de tempo médias de: 0,77 ± 0,14 (2h), 2,5 ± 0,59 (4h), 1,67 ± 0,56 (6h) e 2,85 ± 0,89 (8h) (GRÁF. 4). A diferença entre os grupos controles e tratados foi significativa em todos os intervalos de tempo (P<0.0001), pelos testes Kruskal-Wallis e Dunn’s.
Gráfico 05: Análise quantitativa da dinâmica do número de células do infiltrado inflamatório nos diferentes intervalos de tempo (2, 4, 6 e 8) horas após injeção do veneno. Diferença estatística significativa entre os grupos tratados e controles a partir de 2h de injeção, pelo teste
Kruskal-Wallis e Dunn’s, ***P<0, 001.
5.3 Apoptose no Endotélio
A partir de 2 horas de injeção do veneno, observou-se, em alguns vasos, a presença de células endoteliais contraídas, apresentando perda de adesão entre si e com a MEC (anoiquia), contendo núcleo retraído, carioteca irregular e cromatina condensada, caracterizando apoptose (FIG. 21). Adicionalmente, células endoteliais em apoptose estavam presentes na interface trombo-vaso a partir de 2 horas de injeção (FIG. 22)
FIGURA 21 -Pele de coelho: (A) grupo controle- vaso sanguíneo- célula endotelial (seta preta); Grupo tratado- células endoteliais em apoptose (setas pretas indicando as células endoteliais perdendo a adesão com a parede do vaso e a condensação de cromatina): (B) e (C) - ver detalhes 2 h, (D) 4 h, (E) 6 h e (F) 8 horas após a injeção de 0,5 µg de
Loxosceles similis, Coloração: azul de toluidina (cortes semi-finos),
FIGURA 22 – Pele de coelho: (A) e (B) apoptose de células endoteliais na interface trombo-vaso (setas) 2 horas após a injeção de 0,5 µg de
Loxosceles similis. Coloração: azul de toluidina (cortes semi-finos),
Barra=10 µm.
5.4 Marcação de heterófilos através da reação de imunoistoquímica
Através de seções de pele de coelhos injetados com veneno de L. similis submetidas às reações de imunoistoquimica para proteínas do citosol verificou-se o predomínio de heterófilos (FIG. 23).
FIGURA 23 - Marcação de heterófilos via reação de imunoistoquímica para calprotectina. (A) Marcação positiva dos heterófilos em vermelho e (b) Infiltrado inflamatório heterofílico; Contra-coloração com hematoxilina. Barra=10 µm.
5.5 Identificação in situ da fragmentação do DNA segundo a técnica de TUNEL (Marcação in situ da fragmentação do genoma com transferase terminal de deoxinucleotídeo)
No local da lesão provocada pela injeção de 0,5 µg de veneno de L. similis, observaram-se células endoteliais marcadas positivamente pela reação de TUNEL. Na pele dos animais controles o mesmo não foi constatado. Adicionalmente, havia células endoteliais com marcação positiva na interface trombo-vaso(FIG. 24 e 25).
FIGURA 24 - Pele de coelho (A) controle (B), (C), (D) e (E) tratado com 0,5 µg de veneno de L. similis a partir de 2 horas de injeção de veneno, setas
indicando células endoteliais marcadas positivamente para as reações de TUNEL. Contra coloração com hematoxilina. Barra= 10 µm
FIGURA 25- Pele de coelho (A) grupo controle; (B) e (C) grupo tratado 4 horas após injeção do veneno, setas indicando células endoteliais marcadas positivamente para as reações de TUNEL na interface trombo-vaso; Contra-coloração com hematoxilina, Barra= 10 µm
5.6 Reações de Imunoistoquímica para Bax
Células endoteliais de fragmentos de pele de coelho inoculadas com veneno de L. similis, com característica de apoptose apresentaram marcação positiva. As reações de imunoistoquímica qualitativas foram positivas para Bax, para as células endoteliais em apoptose (FIG. 26). Houve marcação positiva para Bax também na interface trombo-vaso (FIG.26).
FIGURA 26 – Pele de coelho (A) 2h , (B) 4h , (C) 6 h e (D) 8 horas após injeção de veneno, setas indicando células endoteliais apresentando marcação positiva para as reações de Bax - Contra-coloração com hematoxilina. Barra= 10 µm
6 DISCUSSÃO
No presente trabalho, a injeção intradérmica de 0,5 µg do veneno de
Loxosceles similis em coelhos induziu uma lesão vermelho-arroxeada, quente,
edemaciada e sensível ao toque, caracterizando um processo inflamatório agudo também descrito outros autores na fase inicial do loxoscelismo (FUTRELL et al., 1992; RIBEIRO et al., 2007). A análise macroscópica da lesão 2, 4, 6 e 8 horas após a injeção experimental do veneno indicou que a área lesada aumentou diametralmente e se aprofundou com o passar do tempo, atingindo inclusive a musculatura dorsal do animal. Outros autores fazem menção ao que eles denominaram espalhamento gravitacional do veneno no loxoscelismo induzido por outras espécies de Loxosceles (FUTRELL, 1992; Da SILVA et al., 2004; SWASON & VETTER, 2006). Neste trabalho, o espalhamento do veneno pode ser inferido por meio da ampliação da lesão tanto diametralmente quanto em profundidade. De acordo com Da Silveira et al. (2006), a presença de hialuronidases no veneno, que degradam o ácido hialurônico e resíduos de sulfato de condroitina, pode estar relacionada à difusão radial da lesão. Tais enzimas atuariam também como um fator de disseminação sistêmica, facilitando a difusão de outras toxinas do veneno (Da SILVEIRA et al., 2006).
O veneno de L. similis também apresenta propriedades biológicas e bioquímicas similares as dos venenos de L. gaucho e L. laeta (BÁRBARO et al., 1994; BARBARO & MOTA, 1995). Adicionalmente, ele apresenta características similares ao de L. intermedia quanto ao perfil de bandas proteicas, diferindo apenas na intensidade de algumas bandas (SILVESTRE et al., 2005). Macroscopicamente, Silvestre et al., (2005) observou a habilidade da L. similis induzir dermonecrose em coelhos utilizando 10µg de veneno. No entanto, até o momento não relatos na literatura sobre a lesão histológica provocada pela L. similis.
A injeção experimental intradérmica de veneno bruto de 0,5 µg de L. similis em coelhos resultou uma dermatite aguda fibrino-hemorrágica grave e miosite necrosante, onde se observam: edema, vasodilatação, infiltrado inflamatório predominantemente heterofílico, trombose, exsudação de fibrina, hemorragia,
necrose fibrinóide da parede vascular, além de necrose muscular. As lesões microscópicas foram similares àquelas observadas para as outras espécies de
Loxosceles de importância médica (SMITH & MICKS, 1970; REES et al. 1981;
STRAIN et al.1991; OSPEDAL et al, 2002). No entanto, os estudos que envolvem outras Loxosceles abordam a análise microscópica a partir de seis horas de injeção intradérmica do veneno loxoscélico em coelhos.
Neste estudo foram realizadas análises morfométricas para que se pudesse acompanhar a progressão da lesão histológica e avaliar a significância estatística do edema, da vasodilatação e do infiltrado inflamatório presentes na lesão, já que há poucos estudos que envolvam esses fenômenos no loxoscelismo. A análise morfométrica do diâmetro médio dos vasos sanguíneos mostrou que a diferença estatística foi significativa (P<0,05) entre os animais tratadas e controles em todos os intervalos de tempo. Esses dados mostram que o veneno da L. similis possui ação vasodilatadora, já observada no loxoscelismo induzido por outras Loxosceles, ação que é intermediada pela histamina (RATTMANN et al., 2008; BARBARO et
al., 2010). Vários autores utilizam a morfometria de vasos sanguíneos como
ferramenta de estudo para a vasodilatação (BECK et al., 1984; TERAYAMA et al., 1996; HOTTA et al., 2004). Alterações no calibre vascular começam logo após uma lesão que consequentemente levará a uma vasodilatação. Isso leva a um aumento no fluxo sanguíneo, que também foram observados macroscopicamente nos coelhos injetados com veneno de Loxosceles similis. A vasodilatação é rapidamente seguida por um aumento na permeabilidade vascular, que fará com que líquidos extravasem para o tecido extravascular. Esse extravasamento acentuado de fluidos e o seu consequente acúmulo no tecido intersticial causam o edema. O edema foi avaliado também morfometricamente através da mensuração da espessura da pele, que foi significativamente maior a partir de 2 horas de injeção com veneno de Loxosceles similis. Os presentes resultados são similares aos de Rattmann et al., (2008) que mostraram a ação vasodilatadora e o aumento de permeabilidade induzidos pelo veneno de L. intermedia em modelo de ratos.
Adicionalmente, por meio da mensuração do infiltrado inflamatório mostra-se que ele aumenta progressivamente neste estudo a partir do intervalo de 2 horas se