Os materiais de referência da anfetamina, benzoilecgonina, EDDP, MDA, MDMA, metadona, metanfetamina, e dos PIs deuterados, anfetamina-d6, benzoilecgonina-d3, codeína-d3, MDMA-d5, metanfetamina-d3, metadona-d3 e morfina-d3 (grau de pureza ≥ 99%), em solução a 1 mg/mL em metanol, e os materiais de referência da 6-monoacetilmorfina e dos PIs 6- monoacetilmorfina-d3 e cocaína-d3 (grau de pureza ≥ 99%), em solução a 1 mg/mL em acetonitrilo foram fornecidos pela Cerilliant (Round Rock, EUA). Os padrões de referência da codeína, morfina e do PI EDDP-d3 (grau de pureza > 99,5), em solução a 1 mg/mL em metanol, e o padrão de referência da cocaína (grau de pureza > 99,6%), em solução a 1 mg/mL em acetonitrilo foram adquiridos à Lipomed (Arlesheim, Suíça).
O acetonitrilo, a água e o metanol (grau de pureza adequado para LC-MS) e o formato de amónio (p.a.) foram fornecidos pela Fluka/Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha). O ácido fórmico 98- 100% (p.a.) foi adquirido à Merck (Darmstadt, Alemanha). Outros reagentes utilizados no desenvolvimento da metodologia: acetato de etilo para cromatografia líquida, 2-propanol (p.a.) e tert-butilmetileter (p.a.) foram fornecidos pela Merck (Darmstadt, Alemanha).
3.2. SOLUÇÕES
A partir das soluções-padrão individuais a 1 mg/mL, prepararam-se duas misturas-padrão de trabalho a 10 µg/mL, nos correspondentes solventes orgânicos, metanol ou acetonitrilo. A partir destas, prepararam-se diluições de modo a obter misturas-padrão de trabalho a 1; 0,1 e 0,01 µg/mL.
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A partir das soluções-padrão individuais dos PIs deuterados, anfetamina-d6, codeína-d3, metanfetamina-d3 e morfina-d3 a 1 mg/mL, preparou-se uma mistura-padrão a 10 µg/mL em metanol. A partir das soluções-padrão individuais dos PIs, benzoilecgonina-d3, EDDP-d3, MDMA-d5 e metadona-d3, preparou-se outra mistura-padrão a 10 µg/mL em metanol. A partir da diluição adequada destas duas misturas-padrão, preparou-se uma mistura-padrão de trabalho com uma concentração final de 1 µg/mL para a anfetamina-d6, codeína-d3, metanfetamina-d3 e morfina-d3, e de 0,1 µg/mL para a benzoilecgonina-d3, EDDP-d3, MDMA-d5 e metadona- d3 em metanol.
A partir das soluções-padrão individuais dos PIs deuterados 6-acetilmorfina-d3 e cocaína-d3 a 1 mg/mL, prepararam-se duas soluções-padrão individuais a 10 µg/mL em acetonitrilo. A partir da diluição adequada destas duas soluções-padrão preparou-se uma mistura-padrão de trabalho com uma concentração final de 1 µg/mL para a 6-monoacetilmorfina-d3 e de 0,1 µg/mL para a cocaína em acetonitrilo.
Todas as soluções-padrão individuais e misturas-padrão foram armazenadas a -20ºC e protegidas da luz solar.
A mistura de metanol/acetonitrilo (3:1, v/v) foi preparada num frasco de 250 mL ao qual se adicionaram 180 mL de metanol para LC-MS e 60 mL de acetonitrilo para LC-MS, medidos com a ajuda de duas provetas de volume adequado. A mistura foi devidamente homogeneizada e mantida a uma temperatura de 2 a 8ºC.
O solvente A da fase móvel, acetonitrilo/formato de amónio 2 mM (ácido fórmico 0,1%) (95:5, v/v), foi preparado num balão volumétrico de 1000 mL ao qual foi adicionado acetonitrilo para
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proveta. Ao volume remanescente no balão foram adicionados 50 mL de uma solução de formado de amónio 2 mM (ácido fórmico 0,1%), agitando até homogeneizar.
O solvente B da fase móvel, formato de amónio 2 mM (ácido fórmico 0,1%)/acetonitrilo (95:5, v/v) foi preparado num balão volumétrico de 1000 mL ao qual se adicionaram cerca de dois terços do seu volume de água para LC-MS, 2 mL de formato de amónio 1 M e 1 mL de ácido fórmico e agitou-se. Perfez-se o volume do balão volumétrico com água para LC-MS e homogeneizou-se. Posteriormente, retirou-se 50 mL, com a ajuda de uma proveta e adicionou- se ao volume remanescente no balão 50 mL de acetonitrilo para LC-MS. Agitou-se até homogeneizar.
Para a preparação da solução aquosa de formato de amónio 1 M, pesaram-se na balança analítica 3,135 g de formato de amónio, transferiu-se para uma balão volumétrico de 50 mL ao qual se adicionou cerca de dois terços do seu volume de água para LC-MS. Agitou-se até à dissolução completa e perfez-se com água para LC-MS. A solução foi devidamente homogeneizada e mantida a uma temperatura de 2 a 8ºC.
A mistura de solvente B/solvente A (9:1, v/v) foi preparada num frasco de 50 mL ao qual se adicionaram 45 mL do solvente B, medidos com a ajuda de uma proveta, e 5 mL do solvente A, medidos com a ajuda de uma pipeta de vidro graduada. A mistura foi devidamente homogeneizada e mantida a uma temperatura de 2 a 8ºC.
3.3. EQUIPAMENTOS
Balança analítica da Kern & Sohn GmbH, modelo 770-13 (Balingen-Frommern, Alemanha);
Banho seco da Grant Instruments (Cambridge) Ltd, modelo QBT2 (Royston, Reino Unido);
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Banho de ultrassons equipado com termóstato da Branson® 3510 E-DTH (Danbury, CT, EUA)
Câmara de fluxo laminar da Labcaire, modelo SC 12-R (Inglaterra);
Centrifuga da Thermo-Heraeus, modelo Megafuge 1.0 (Osterode, Alemanha);
Cromatógrafo de líquidos UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography), modelo Acquity, composto por: uma bomba binária; um injetor automático de volume variável com sistema de refrigeração para as amostras e um forno para a coluna cromatográfica, acoplado a um espectrómetro de massa/massa com um analisador do tipo triplo quadrupolo e fonte de ionização ESCi, modelo Acquity TQ Detector, controlado pelo
software MassLynx, versão 4.1 SCN 919, da Waters (Milford, MA, EUA);
Dispensadores de volume variável da Eppendorf (Hamburgo, Alemanha); Estufa, modelo UM300 da Memmert GmbH (Schwabach, Alemanha);
Evaporador de amostras da Caliper Life Sciences, modelo TurboVap LV (Mountain View, CA, EUA);
Homogeneizador, modelo SRT2 da Stuart Scientific (Redhill Surrey, Reino Unido); Micropipetas de volume variável de 10 – 100 µL; 20 – 200 µL e de 100 – 1000 µL da
Eppendorf (Hamburgo, Alemanha);
Vortex, modelo ZX3 da Velp Scientifica srl (Usmate, Itália)
3.4. MATERIAIS
Para além do material de vidro e dos consumíveis correntes em laboratório, foram utilizados os cartões Whatman® BFC 180 e foram testados durante o desenvolvimento da metodologia também os cartões: Whatman® 903, Whatman® FTA DMPK-A, B e C, Whatman® FTA Elute fornecidos pela GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ, EUA) e os cartões Bond Elut
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DMS adquiridos à Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EUA). Foram ainda utilizados, para o armazenamento das amostras, envelopes Multi-Barrier da Whatman® e um agente excicante em saquetas individuais de 1 g, fornecidos pela GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ, EUA).