Na operação farmacêutica denominada dissolução extrativa ou extração (do latim
extractio, derivado de extrahere, retirar), o solvente apropriado dissolve, em geral, parte dos
constituintes da droga, deixando um resíduo formado de elementos inertes indesejáveis, tendo como objetivo a retirada seletiva de substâncias ou fração ativa do material vegetal (SIMÕES
et al., 2003).
A extração é um importante passo para estudos envolvendo a descoberta e isolamento de compostos ativos a partir de matrizes vegetais (SCHINOR et al., 2004), além de ser importante para a obtenção de extratos brutos ou particionados para desenvolvimento de fitoterápicos. A escolha do método extrativo deve considerar a estabilidade das substâncias extraíveis, a eficiência do processo, seu custo e viabilidade. Os métodos clássicos de extração baseiam-se no poder de extração de diversos solventes, com uso ou não de calor ou agitação (Figura 8) (SCHINOR et al., 2004).
Na maceração, a extração ocorre em recipiente fechado, em temperatura ambiente, com agitação ocasional e leva longos períodos, pois é um processo estático, sem renovação de solvente e não conduz, na maioria das vezes, ao esgotamento do material vegetal, seja devido à saturação do líquido extrator ou ao equilíbrio difusional entre o solvente extrator e o meio intracelular. Há alterações que podem ser feitas para aumentar a eficiência da maceração, como a utilização de sistemas aquecidos (digestão), de agitação mecânica constante (maceração dinâmica) ou ainda de renovação do solvente extrator (remaceração). É uma técnica simples, bastante utilizada, com custo relativamente reduzido em comparação aos outros métodos de extração (BRASIL, 2011; AZMIR et al., 2013).
A percolação é um processo dinâmico, onde o solvente extrator arrasta as substâncias extraíveis com sua passagem constante através do material vegetal (BRASIL, 2011).O caráter dinâmico agiliza o tempo requerido para o processo extrativo ser concluído e exige equipamento específico que permita o fluxo de solvente através do matriz a ser extraída.
A turbólise ou turbo-extração ocorre através da aplicação de elevadas forças de cisalhamento que ao mesmo tempo promovem a redução do tamanho de partículas e a extração, estando essa técnica relacionada a um menor tempo necessário para o processo e quase total esgotamento do material vegetal.
O processo de infusão ocorre quando ao material vegetal, geralmente rasurado, é vertido certo volume de água fervente, onde permanece por certo tempo. Já na decocção, o material vegetal é adicionado a certo volume de água, sendo o sistema submetido a aquecimento até ebulição (BRASIL, 2011). A infusão e a decocção são geralmente utilizadas como técnicas de extração de materiais vegetais in natura, para uso extemporâneo dos extratos resultantes.
Podem ser utilizados sistemas fechados para a extração a quente, como através de arraste de vapor de água, que se aplica à extração de óleos voláteis, que possuem tensão de vapor mais elevada do que a água. Em pequena escala é utilizado o aparelho de Clevenger. A extração por Soxhlet utiliza equipamento específico, que possibilita extração em ciclos cujo contato do material vegetal sempre é feito por solvente renovado através de destilação (AHAMAD et al., 2010; AZMIR et al., 2013).
Os maiores desafios dos métodos convencionais de extração são o longo tempo necessário, alto custo, investimento em solventes com alto grau de pureza, baixa seletividade e decomposição térmica (SHIRSATH et al., 2012; AZMIR et al., 2013). Os métodos não convencionais de extração vêm se desenvolvendo há 50 anos e são menos prejudiciais ao meio ambiente devido à diminuição na utilização de solventes orgânicos, reduzido tempo de operacionalização, melhor rendimento e qualidade do extrato (AZMIR et al., 2013).
A extração assistida por micro-ondas tem emergido como rápida e eficaz técnica para extração de produtos naturais. O aquecimento causa ruptura de ligações de hidrogênio provocada pelas interações dipolo moleculares. A migração de íons dissolvidos facilita a penetração de moléculas de solventes na matriz, promovendo a solvatação dos componentes a serem extraídos (ZULOAGA et al., 1998; KAUFFMAN et al., 2007). Comparado com os métodos tradicionais de extração, a assistida por micro-ondas possui muitas vantagens, como o tempo curto, utilização de menos solvente, alta taxa de extração e melhores produtos com menor custo, já que as micro-ondas aquecem o solvente diretamente e essa interação com as moléculas de água livres nas glândulas e sistemas vasculares vegetais resultam na ruptura das células do tecido vegetal e liberação dos compostos ativos no solvente (CHEN et al., 2007).
A extração assistida por ultrassom apresenta-se como técnica extrativa promissora por possibilitar a extração exaustiva de princípios ativos de drogas vegetais com gasto de energia relativamente pequeno, economia de tempo e maior segurança no processo. As ondas de ultrassom com frequência acima de 20 kHz são geradas por um transdutor que converte energia elétrica em mecânica. Essas ondas propagam-se no meio líquido, originando variações de pressão, responsáveis pela cavitação (BARBOZA e SERRA, 1992). Cavitação é definida como o ciclo de formação, crescimento e colapso de bolhas micrométricas durante a sonicação, com cujos colapsos ocorre a liberação de grande quantidade de energia para o meio proporcionando, na microrregião em seu entorno, aumento da temperatura da ordem de alguns graus centígrados e da pressão para centenas de atmosferas. Tal colapso favorece a extração de espécies químicas a partir de materiais sólidos, bem como a dissolução destes (KORN et
al., 2005), além de produzir um efeito vibratório também na célula vegetal, capaz de levá-la a
ruptura e, com isso, a liberação do seu conteúdo (SILVA e ARAGÃO, 2009; LI et al., 2011). Os possíveis benefícios da extração por ultrassom são a intensificação de transferência de massa, ruptura da unidade celular, aumento de penetração do solvente e efeitos de capilaridade (TOMA et al., 2001).
A extração por fluido supercrítico pode ser aplicável a matrizes vegetais sólidas (KHAJEH, 2011) e consiste numa técnica alternativa para extração sólido-líquido por oferecer muitas vantagens, como o curto tempo para extração, consumo menor de solvente e reduzida temperatura de trabalho. A extração de constituintes muito polares não é tão estudada e aplicável devido à baixa polaridade do gás de arraste, o gás carbônico, sendo útil na extração de óleos essenciais, mas havendo relatos de extração de alcaloides (BRACHET et
al., 2000a). O uso de dióxido de carbono como gás carreador no processo de extração por
facilidade de retirada do gás do extrato (BALACHANDRAN e ASHOKKUMAR, 2006; KHAJEH, 2011).
Matérias-primas vegetais empregadas na produção de medicamentos fitoterápicos podem apresentar variações qualitativas e quantitativas na sua composição química, dependendo das condições climáticas e agronômicas de cultivo. As várias possibilidades de extração podem resultar em produtos distintos quanto à qualidade e concentração de ativos, levando a resultados terapêuticos variáveis (AREND et al., 2011) e diferentes custos finais. Assim, é necessária a definição dos parâmetros de qualidade, bem como a padronização da preparação dos extratos.
Todas as técnicas de extração apresentam vantagens e desvantagens, e em todas elas deve ser avaliada a sua capacidade de extrair os compostos de interesse em concentrações bioativas (LIAZID et al., 2010) e de forma reprodutível, dependendo do método e dos parâmetros de extração, além da natureza do material vegetal (POOLE et al., 1990; NORIEGA, SOUZA, et al., 2012).
Por tudo isso, o processo de otimização da extração envolve diversas condições de temperatura além da comparação entre métodos e diferentes líquidos extratores (álcool em várias diluições, adição de tensoativos às soluções álcool-água ou apenas água) (CELEGHINI
et al., 2007).
Há inúmeros fatores que afetam a eficiência de um processo extrativo: divisão da droga vegetal; agitação, temperatura, tempo, solvente, proporção droga:solvente. O tamanho de partículas está diretamente ligado ao grau de preparo, ou seja, a eficiência de ruptura das membranas celulares e quanto menor o tamanho de partículas, mais eficiente o processo extrativo graças ao aumento da superfície de contato como solvente extrator. O formato, o tamanho e a rigidez exercem influência direta na distribuição do líquido de extração na matriz sólida (PRISTA et al., 1995; AZEVEDO, 1996).
A agitação promove renovação do solvente em contato com a droga, aumentando a taxa de difusão, o que pode abreviar a duração do processo (PRISTA et al., 1995). Altas temperaturas favorecem a extração, aumentando a difusão celular, reduzindo a viscosidade e melhorando o contanto solvente extrator-material vegetal (LAMUSSE, 1980). Altas temperaturas podem aumentar a quantidade de polissacarídeos e precipitação de pectina a partir de tecidos vegetais, aumentando a viscosidade da solução e assim afetando a dissolução dos componentes ativos (FU, CHENG, et al., 2013). A contribuição positiva de um tempo maior de extração deve ser balanceada com possíveis prejuízos dessa exposição demorada para os constituintes químicos (AZEVEDO, 1996). Tempo e temperatura são fatores
interessantes a serem otimizados, visando a redução do custo energético do processo de extração (SPIGNO et al., 2007). A escolha do solvente está relacionada à polaridade das substâncias extraíveis, devendo também serem considerados os seguintes fatores: afinidade molecular entre soluto e solvente, transferência de massa, uso de co-solvente, segurança ambiental, toxicidade e custos (PRISTA et al., 1995; AZMIR et al., 2013). A proporção droga:solvente relaciona-se de forma direta de modo que quanto mais diluído o sistema, maior a taxa de extração, de um modo geral (AZEVEDO, 1996).
Comparado a outras técnicas modernas de extração, como micro-ondas ou fluido supercrítico, a extração assistida por ultrassom é mais segura, menos poluente, mais econômica e mais fácil de ser utilizada (LIANG e WU, 2013; TENG e CHOI, 2014). Atualmente, a extração assistida por ultrassom tem sido utilizada para extrair componentes com potenciais atividades biológicas, tais como flavonoides, polifenóis, hidrocarbonetos saturados, ésteres de ácidos graxos, esteroides, triterpenoides, saponinas (JIANYONG et al., 2001; PANIWNYK et al., 2001; ALBU et al., 2004; SCHINOR et al., 2004; MELECCHI et
al., 2006; HU et al., 2008).
Essa técnica também é aplicada de maneira eficiente na preparação de amostras para análise de pesticidas em sementes e mel, reduzindo inclusive os custos de análise (PAN et al., 2008) e também é utilizada na obtenção de fitofármacos como artemisina, antimalárico, cuja síntese é muito cara e necessita de técnicas otimizadas para sua extração a partir das folhas de
Artemisia annua (KALIL et al., 2011).
Várias técnicas foram utilizadas na extração de alcaloides a partir de raízes de Coptis
chinensis Franch, como extração iônica, água quente pressurizada, fluido supercrítico, agentes
modificadores, mas houve melhor resultado com a utilização da extração assistida por ultrassom (TENG e CHOI, 2014). A extração das folhas de Rosmarinus officinalis foi avaliada conforme atividade antioxidante, concluindo-se que extratos obtidos a partir de etanol eram menos ativos quando eram utilizados métodos convencionais de extração, como maceração. Quando foi testada a extração assistida por ultrassom, houve aumento da atividade antioxidante dos extratos obtidos (PANIWNYK et al., 2009). A comparação de vários métodos de extração de óleos de Punica granatum L descreveu a extração assistida por ultrassom como o mais efetivo em termos de teor de marcador químico (TIAN et al., 2013). A extração por ultrassom proporcionou diminuição do tempo e da temperatura necessários para extração de Quillaja saponaria Molina comparado ao método convencional de maceração. Em relação à proporção droga:solvente, neste caso, quanto menor maior a eficiência da
extração assistida por ultrassom, pois favorece a cavitação e exposição da matriz ao solvente (GAETE-GARRETÓN et al., 2011).
Assim, a extração assistida por ultrassom aponta como bastante promissora na obtenção de insumos vegetais, sobretudo por exigir menos tempo e menor quantidade de solvente.
3.5. Quimiometria
O desenvolvimento de fitoterápicos visa à obtenção de formas farmacêuticas onde o potencial químico e terapêutico do vegetal deve ser preservado e valorizado (OLIVEIRA et
al., 2001), sendo assim necessária a busca pela otimização do processo extrativo, primeira
etapa produtiva após a coleta do material vegetal. A palavra “otimizar” significa fazer tão perfeito, efetivo ou funcional quanto possível (NORIEGA et al., 2005), e esse objetivo pode ser conseguido com o auxílio da quimiometria.
A quimiometria consiste numa disciplina química que emprega métodos matemáticos e estatísticos para planejar ou selecionar experimentos de forma otimizada e para fornecer o máximo de informação química com a análise dos dados obtidos (FERREIRA et al., 1999). Os trabalhos em quimiometria no Brasil podem ser agrupados em três áreas principais: planejamento e otimização de experimentos, reconhecimento de padrões (métodos de análise exploratória e classificação) e calibração multivariada. Os planejamentos experimentais mais usados no Brasil são os fatoriais, completos ou fracionários, e os planejamentos compostos centrais (BARROS-NETO et al., 2006).
O planejamento experimental consiste na triagem das condições de realização de um experimento e todas as suas possíveis combinações de forma multivariada, ou seja, os níveis das variáveis são alterados concomitantemente e um tratamento estatístico define o quanto cada alteração é significativa ao processo estudado (MONTGOMERY, 2009). Tal metodologia, também chamada de design de experimentos (DOE), oferece o máximo de retorno em termos de informação sobre a influência de múltiplos fatores, enquanto requer trabalho e investimento menores (NORIEGA, MAFUD, et al., 2012).
Para delinear um planejamento experimental, é necessário seguir 5 passos (BARROS- NETO et al., 2001; LEARDI, 2009; MONTGOMERY, 2009):
- definir o objetivo dos experimentos; - detectar todas as possíveis variáveis;
- filtrar as variáveis, definir os níveis a serem testados, definir o design e planejar o experimento;
- realizar os experimentos em ordem aleatória e estimar o erro experimental através de replicatas;
- analisar os dados obtidos e transformá-los em conclusão lógica do planejamento experimental.
Um experimento para triagem é executado com o interesse em se determinar as variáveis experimentais e as interações entre elas que têm influência significativa sobre as diferentes respostas de interesse. Depois que os níveis de cada uma das variáveis são escolhidos, o planejamento experimental completo deve ser avaliado, podendo-se incluir a análise de superfície de resposta, na busca de um ponto ótimo onde saberemos as melhores condições de operação do sistema avaliado (TEÓFILO e FERREIRA, 2006) através da descrição da significância e efeito de cada variável, e suas interações, e da avaliação de modelo matemático gerado (BARROS-NETO et al., 2001).
A resposta avaliada no planejamento experimental recebe tratamento estatístico de modo a serem conhecidos os fatores e interações que exercem influência estatisticamente significativa sobre ela e pode ser tratada utilizando-se algumas ferramentas, como o gráfico de pareto e o gráfico de superfície de resposta.
O gráfico de pareto (Figura 9) expõe a sensibilidade dos parâmetros estudados sobre o fator resposta e através dele torna-se visível a relação ação/benefício, priorizando a ação ou variável que terá mais resultado, que será mais significativa. Consiste em um gráfico de barras que ordena as frequências de ocorrências da maior para a menor, permitindo identificar as variáveis, e suas interações, significativas de forma bastante clara (BARBOSA, 2009). Há uma delimitação estatística da significância através de uma linha vertical (p=0,05) à direita da qual os retângulos no gráfico representam os efeitos significativos e os valores ao lado do retângulo geralmente representam os valores da estatística do teste t (CALADO e MONTGOMERY, 2003). Os efeitos padronizados também podem ser expressos ao lado desse retângulo e, quando negativos, significam que houve diminuição da resposta migrando do nível menor para o maior, quando positivos, significam que houve aumento da resposta migrando do nível menor para o maior.
Figura 9 – Ilustração de exemplo de gráfico de pareto em função dos valores de estatística do teste t.
O gráfico de superfície de resposta (Figura 10) mostra uma superfície tridimensional que conecta um conjunto de dados, possibilitando a visualização de combinações desses dados e o fator resposta associado a elas, facilitando o encontro da melhor combinação entre as variáveis avaliadas. No caso do planejamento experimental comum terá a forma de um plano, visto que o modelo matemático é linear. No caso de tratamentos estatísticos como a metodologia de superfície de resposta, o gráfico deve ser elíptico, associado a modelos de primeira e segunda ordem. É construído utilizando-se diferentes cores, relacionadas à intensidade do fator resposta equivalente a cada conjunto de combinação de variáveis (CALADO e MONTGOMERY, 2003).
O planejamento experimental vem sendo largamente utilizado na área industrial, já que é crucial para o desenvolvimento e aprimoramento de processos de produção, permitindo
Figura 10 – Ilustração de exemplo de gráfico de superfície de resposta de modelo quadrático (A) e linear (B)
a identificação de falhas ou fatores que podem ser alterados de forma a aumentar a produção e diminuir o custo final do produto, mas também tem se mostrado de maior importância em diversas áreas como, por exemplo, em pesquisas científicas e se justifica como boa alternativa para se identificar, de forma relativamente rápida e simples, condições ótimas de processos simples e diversos.
O uso de planejamentos experimentais na indústria farmacêutica não é uma ferramenta apenas para otimização de resultados e redução de variabilidade dos processos, mas também contribui para o conhecimento de processos e pontos críticos (SILVA e SANT´ANNA, 2007). O planejamento experimental tem sido amplamente utilizado na otimização de processos de extração, seja de matrizes vegetais (BRACHET et al., 2000a; OLIVEIRA et al., 2001; AREND et al., 2011; NORIEGA, MAFUD, et al., 2012; TIAN et al., 2013), de compostos fenólicos de vinhos (DOPICO-GARCÍA et al., 2007; PUÉRTOLAS et al., 2011), ou de constituintes ativos de frutos (CALABRÓ et al., 2004). Estudos desse tipo também têm sido desenvolvidos na otimização de métodos para extração de alcaloides (BRACHET et al., 1999; BRACHET et al., 2000a; BRACHET et al., 2000b; BRACHET et al., 2002; KAUFFMAN et al., 2007), como é realizado no presente estudo.