Long-run inequality in Norway: A series of episodes

3.2.1. Estudo dos moluscos

Após chegarem ao laboratório, os moluscos foram contados, identificados e separados consoante a espécie e o habitat de proveniência.

Os moluscos identificados como L. truncatula foram expostos à luz artificial para estudos parasitológicos e colocados em etanol absoluto e conservados a 4ºC, para os estudos morfológicos e de biologia molecular.

3.2.1.1.Identificação morfológica

A identificação dos moluscos foi feita com base na morfologia da concha (Hubendick, 1951, Malek & Cheng, 1974) (Figura 5).

3.2.1.2. Presença de F. hepatica

3.2.1.2.a. Pesquisa da eliminação de cercárias

Todos os moluscos colhidos foram expostos a uma fonte de luz artificial, para estimular a eliminação de cercárias, caso eles estivessem infectados. Assim, colocaram- se os moluscos dentro de copos de vidro de 50 ml, com água, sob a acção de uma fonte de luz artificial (candeeiro com lâmpada de 60W) durante 2 horas. Seguidamente retiraram-se os moluscos dos recipientes e observou-se a água neles contida, recorrendo a um estereomicroscópio para pesquisa de cercárias. Este procedimento foi repetido nos que continuaram vivos, até sessenta dias após a colheita dos moluscos.

3.2.1.2.b. Pesquisa de DNA de F. hepatica nos moluscos

De todos os moluscos colhidos escolheram-se 110 moluscos [110 identificados como L. truncatula e 3 como Lymnaea sp (colhidos na ilha da Madeira)] para pesquisa de DNA de F. hepatica no molusco por PCR – Polymerase Chain Reaction.

Foi extraído DNA total da região cefalopodal do molusco (formada pela cabeça e pelo pé) com CTAB (descrição no capítulo II)

As Sequências Iniciadoras (SeqIn) (primer) usadas foram descritas por (Magalhães et al., 2004), para amplificar regiões conservadas e repetitivas do DNA mitocondrial do (mtDNA) de F. hepática, que consiste em repetições idênticas, em

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tandem, de 85 nucleótidos (ricas em guaninas e citosinas): FASCF (5’ ATA TTA AGA GTT GTG CCC C 3’) e FASCR (5’ CCA AAT AAA TAG ATC AGC CC 3’).

As amostras foram sujeitas a um ciclo de desnaturação a 92ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de 92ºC, 1 min; 55ºC, 2 min e 72ºC, 2 min, e por fim um ciclo para extensão da cadeia, a 72ºC durante 10 minutos.

Terminada a reacção, 5 µl do produto foi observado num gel de agarose a 2%, com 3 µl de tampão de deposição e por fim observou-se a fluorescência emitida num documentador de imagem AlphaImager HP (Alpha Innotech). Juntamente com as amostras foi colocado um marcador de massa molecular de 1000 pares de bases - “Hyperladder IV” (Bioline).

As amostras foram todas purificadas, usando colunas de purificação QIAquick PCR™ da QIAGEN, e sequenciadas num sequenciador automático comercial (STABvida) (técnicas descritas no capítulo II).

3.2.2. Análise da água dos habitats

Foram doseados os seguintes parâmetros: dureza total e dureza carbonatada, sulfatos, nitratos, nitritos, amónio, cloro e cálcio e magnésio, pela importância de que se podem revestir no que respeita à presença de moluscos.

Dureza total, Dureza carbonatada, Cálcio e Magnésio

A dureza total da água é um parâmetro que está dependente da quantidade dos chamados «iões formadores de dureza», iões de cálcio (Ca2+) e Magnésio (Mg2+) presentes na água. A determinação da dureza total compreende a soma desses iões e é expressa em mg de óxido de cálcio (CaO) por litro de água.

A dureza carbonatada é, de entre os iões de Ca2+ e Mg2+, presentes em 1 litro de água, a quantidade equivalente de iões hidrogenocarbonato (HCO3-) e iões carbonato

(CO32-). A relação de HCO3- e CO32- depende dos valores de pH. Em águas com pH

ácido (abaixo de 5,6), os moluscos apresentam dificuldade de promover a deposição do cálcio para a constituição da concha, impedindo a sua colonização (MSBrasil, 2007).

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Sulfatos

As águas subterrâneas e superficiais contaminadas podem conter 300 mg ou mais de iões sulfato (SO42-)por litro de água, tratando-se assim de um bom indicador de

contaminação.

Nitratos

A carga crescente de nitratos nas águas subterrâneas e na água potável proveniente destas, apresenta cada vez mais um problema sanitário do ambiente, que tem efeitos principalmente na agricultura de uso intensivo. O nitrogénio dos nitratos atinge as águas superficiais e as subterrâneas por arrastamento, devido a uma fertilização fora de tempo e uma sobredose. Os nitratos são elementos essenciais ao desenvolvimento do plâncton, fundamental para alimento dos moluscos (MSBrasil, 2007).

Nitritos, amónia, cloretos

Em certas condições de anaerobiose, algumas bactérias desnitrificantes reduzem os nitratos a nitritos, assim como algumas outras reduzem nitritos a amónia. Estes dois parâmetros são, portanto, bons indicadores de poluição das águas, com efeitos nefastos ao desenvolvimento dos moluscos (MSBrasil, 2007).

Dado que se tratam de moluscos de água doce não seria de esperar muita tolerância ao cloro, no entanto, já foram encontrados níveis relativamente elevados de cloretos e até mesmo de amónia em vários habitats de moluscos (MSBrasil, 2007).

Cádmio, chumbo, cobre, níquel e zinco

Para verificar o grau de contaminação dos cursos de água estudados, efectuou-se ainda a pesquisa e doseamento de metais pesados: cádmio, chumbo, cobre, níquel e zinco.

Para os doseamentos utilizou-se uma técnica colorimétrica semi-quantitativa (Merckoquant®) de acordo com o protocolo do fabricante.

3.2.3. Análise das fezes de animais

A análise de fezes de animais para pesquisa de ovos de F. hepatica foi efectuada recorrendo à técnica de Telemann-Lima. A escolha desta técnica de concentração prende-se com o facto dos ovos de F. hepatica serem “grandes” e “pesados” e terem tendência para sedimentar.

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Esta técnica baseia-se na obtenção de uma emulsão com duas fases não miscíveis, em que uma delas é aquosa e outra lipófila, permitindo assim separar as partículas fecais (parasitas, resíduos alimentares, bactérias). A separação processa-se de acordo com o equilíbrio hidrófilo-lipófilo, dos elementos da amostra, resultando na eliminação das fracções com predominância lipofílica, dado que são aqueles artefactos que mais interferem na visualização das preparações. Obtém-se assim uma concentração das partículas com predominância hidrofílica. No presente estudo preparou-se uma emulsão com cerca de 20 cm3 de água destilada, o equivalente a uma colher de café de fezes. A preparação obtida foi coada através de duas espessuras de gaze. O filtrado foi dispensado para um tubo de centrífuga enchendo-o até um terço da sua altura e, ao qual se adicionou igual volume de uma mistura feita com água e éter etílico, em partes iguais. O tubo foi tapado com uma rolha e agitado vigorosamente. A mistura foi centrifugada a 3000G (centrífuga HERMLE Z383K) durante 3 minutos. Após decantação, o sedimento foi observado entre lâmina e lamela de 22mmx22mm.

Foram analisadas 20 amostras de fezes de animais, 18 da Tapada Nacional de Mafra e 2 do distrito de Évora.

3.2.4. Análise dos fígados de animais

Foram feitas pesquisas de parasitas adultos F. hepatica em fígados de gamos e javalis abatidos em caçada na Tapada Nacional de Mafra. Os fígados foram colocados num tabuleiro de alumínio e com a ajuda de uma pinça e bisturi, foram abertos os canais biliares e exercida pressão sobre o fígado para forçar a saída de eventuais parasitas presentes no interior desses canais.

No total foram analisados 5 fígados de animais, 3 de gamo, e 2 de javali.