Lojalitetsprogrammets effekt på kundelojalitet

Na última década muitos laboratórios de pesquisa, incluindo o meu, têm tido uma abordagem de tentar melhorar o potencial de desenvolvimento do oócito pós-MIV por inibição, ou pelo menos diminuindo, a maturação meiótica espontânea do oócito in vitro. A lógica por trás deste tipo de abordagem é que a MIV do oócito espontâneo pode ser considerada como um tipo de maturação “precoce” do oócito, porque; i) o oócito, de outro modo, pode permanecer meioticamente parado e ainda estar desenvolvendo in vivo, adquirindo competência para o desenvolvimento, ii) o recomeço da meiose in vitro ocorre muito rapidamente, independentemente do grau de competência de desenvolvimento adquirida, e iii) a MIV espontânea provoca uma ruptura prematura das junções gap comunicantes do oócito-CC (Thomas, et al., 2004a), levando à perda de metabólitos essenciais das células do cumulus, tais como íons, aminoácidos e nucleotídeos (Gilchrist & Thompson, 2007). Assim, uma estratégia para tentar melhorar o potencial de desenvolvimento do oócito in vitro consiste em retardar ou impedir temporariamente a maturação nuclear espontânea, ao mesmo tempo promover o desenvolvimento de ooplasma. No contexto da MIV, isto é geralmente obtido através de coleta e cultivando de COCs imaturos durante pelo menos 24 horas (até 48 horas) com um agente inibidor na meiose. Após a remoção do inibidor, a maturação do oócito é liberada para continuar antes da FIV. Os objetivos desses sistemas MIV são prolongar as junções gap comunicantes do oócito-CC in vitro e permitir o acúmulo contínuo de mRNA e proteínas no ooplasma (Thomas, et al., 2004b; Gilchrist & Thompson, 2007).

Que abordagens estão disponíveis para atrasar ou atenuar a MIV espontânea do oócito? Os mecanismos que regem a parada e o recomeço meiótico dos oócito de mamíferos têm sido estudados em grande profundidade, particularmente em roedores, e há uma grande variedade de abordagens para regular artificialmente o reinício meiótico do oócito in vitro. Um modelo de maturação induzida do oócito é bem estabelecido para oócitos de camundongos, sendo que o reinício meiótico está bloqueado pelas purinas (como hipoxantina) e, em seguida, o recomeço meiótico é induzido por FSH ou EGF (Eppig & Downs, 1987). Infelizmente, este modelo não é o prioritário em quase todos os oócitos de não - roedores examinados até agora e assim estratégias alternativas são necessárias.

2.2.1. Uso de Inibidores de Quinase durante a MIV para Melhorar a Qualidade do Oócito

A maturação espontânea do oócito pode ser evitada em espécies de animais domésticos usando-se vários inibidores quinase ciclina-dependente específicos (por exemplo, butirolactona I e roscovitina), que inibem a atividade do fator promotor da maturação (FPM) do oócito. A eficácia do uso desses vários inibidores de quinase na MIV, para melhorar o potencial de desenvolvimento embrionário pós MIV estão resumidas na Tabela 1 (Gilchrist & Thompson, 2007). Estes estudos ilustram que controlar a progressão espontânea da meiose pela manipulação da atividade da FPM, em geral ou afeta contrariamente (Lonergan, et al., 1997; Avery, et al., 1998; Anderiesz, et al., 2000; Dode & Adona, 2001; Adona & Lima Verde Leal, 2004) ou pelo menos não tem nenhum efeito positivo (Lonergan, et al., 2000; Mermillod, et al., 2000; Wu, et al., 2002; Adona & Lima Verde Leal, 2004; Grupen, et al., 2006) no subseqüente potencial de desenvolvimento do oócito. Entretanto há um relato de uma efetiva melhora na qualidade do oócito (Hashimoto, et al., 2002). Assim, o uso destes inibidores de quinases como aditivos da MIV com objetivo de aumentar a qualidade do oócito, provavelmente não é real (Gilchrist & Thompson, 2007).

Gilchrist, R.B. 2008. Interações oócito-células do cumulus regulando a qualidade do oócito. Oocyte-cumulus cell interactions

2.2.2. Uso de Agentes Moduladores de cAMP durante a MIV para Melhorar a Qualidade do Oócito

É bem conhecido que o segundo mensageiro intracelular cAMP desempenha um importante papel na regulação da maturação do oócito em mamíferos – particularmente nos oócitos de roedores. (revisado (Eppig, 1989)). Os níveis de cAMP podem ser artificialmente aumentados nos oócitos pela adição aos meios MIV de:

i) análogos do cAMP tal como dibutiril cAMP, ii) ativadores da adenilato ciclase, tais como FSH, forscolina,

ou adenilato ciclase invasiva, e/ou iii) inibidores de fosfodiesterase (PDE), tais como o inibidor não-específico IBMX, o inibidor específico de PDE tipo 4 – rolipram, ou os inibidores específicos de PDE tipo 3 - milrinona, cilostimide ou Org9935 (Gilchrist & Thompson, 2007). O tratamento de oócitos durante a MIV com esses agentes que elevam o cAMP, impede o recomeço da meiose dos oócitos de camundongos (Eppig, 1989) e humanos (Nogueira, et al., 2003a; Shu, et al., 2008), mas exerce somente um efeito inibitório transitório no recomeço da meiose em oócitos de animais domésticos (Sirard & First, 1988; Aktas, et al., 1995b; Thomas,

et al., 2002; Thomas et al., 2004a). Entretanto, em contraste à aplicação de inibidores de FPM na MIV, a

adição desses agentes moduladores de cAMP aos meios MIV freqüentemente melhora (Funahashi, et al., 1997; Luciano, et al., 1999; Nogueira, et al., 2003b; Thomas et al., 2004b; Bagg, et al., 2006) ou não tem nenhum efeito prejudicial (Aktas, et al., 1995a; Grupen et al., 2006; Nogueira, et al., 2006; Shu et al., 200) no subseqüente potencial de desenvolvimento do oócito (Tabela 2) (Gilchrist & Thompson, 2007).

Meu laboratório tomou a opção de usar inibidores específicos de isoenzimas PDE para regular diferencialmente os níveis de cAMP nos compartimentos do oócito e das células do cumulus (Thomas et al., 2002). O uso do inibidor de PDE3 milrinona ou o inibidor de PDE4 rolipram, juntos com o FSH, aumenta a produção de embriões pós MIV (Tabela 3; (Thomas et al., 2004b)). Esse efeito positivo no potencial de desenvolvimento do oócito é provavelmente mediado por vários mecanismos. Primeiramente, diminuindo a velocidade do recomeço espontâneo da meiose, a maturação precoce do oócito é atenuada. Junto com os ativadores da adenilato ciclase (como FSH ou forscolina), esses inibidores de PDE atrasam a quebra da vesícula germinativa e simultaneamente aumentam o tamanho e a duração da junção gap-comunicante oócito- CC durante o recomeço da fase de meiose (Figura 1) (Luciano, et al., 2004; Thomas et al., 2004a; Thomas

et al., 2004b; Shu et al., 2008). Supõe-se que isto facilita a troca prolongada de moléculas regulatórias

positivas e de metabólitos das CCs para o oócito, melhorando a qualidade do oócito. (Thomas et al., 2004a; Thomas et al., 2004b). Em segundo lugar, impedindo a retomada imediata da meiose in vitro, os oócitos sofrem uma transição mais regulada e apropriada da prófase-I para metáfase. Por exemplo, a interrupção meiótica in vitro com inibidor de PDE3 permite aos oócitos o momento de transitar de uma configuração de cromatina dispersa para compactada e de uma configuração de nucléolo não-compactado para compactado (Nogueira et al., 2003a; Nogueira et al., 2003b). Essas alterações indicam a transição de um oócito transcricionalmente ativo para inativo (de Smedt et al., 1994; Fair et al., 1995), que parecem ser características normais da fase final de aquisição da competência de desenvolvimento in vivo, antes do pico pré-ovulatório de gonadotrofina (Mattson & Albertini, 1990; Hyttel et al., 1997; Sirard et al., 2006). Assim, a inclusão de inibidores de PDE e/ou agentes relacionados à modulação de cAMP em meios MIV é provavelmente um método útil para aumentar o subseqüente potencial de desenvolvimento do oócito (Gilchrist & Thompson, 2007).

Gilchrist, R.B. 2008. Interações oócito-células do cumulus regulando a qualidade do oócito. Oocyte-cumulus cell interactions

Figura 1. Relação entre a quebra da junção gap comunicante oócito - CC e retomada da meiose do oócito. Os COCs foram cultivados em TCM-199 isentos de FSH ou soro, sozinhos (controle) ou tratados com milrinona e forscolina (100 µM cada). A comunicação através da junção gap comunicante oócito-CC foi medida em grupos de COCs após as primeiras 9 horas de MIV (A), e estes oócitos foram então fixados e avaliados quanto ao recomeço da meiose (B). A milrinona é um inibidor específico de fosfodiesterase tipo-3 e a forscolina é um ativador de adenilato-ciclase, e esta combinação de tratamento aumenta notavelmente os níveis de cAMP no interior do oócito e no COC (Thomas et al., 2002). O aumento de cAMP no oócito atenua a maturação espontânea do oócito; o recomeço da meiose é atrasado por aproximadamente 4 horas, a junção gap comunicante oócito-CC é reforçada e amplificada, e estes fatos estão associados ao aumento do potencial de desenvolvimento embrionário pós-FIV (Tabela 3; (Thomas et al., 2004b)).CC, células do cumulus; GVBD, quebra da vesícula germinativa,

Figura modificada de (Thomas et al., 2004a).

Gilchrist, R.B. 2008. Interações oócito-células do cumulus regulando a qualidade do oócito. Oocyte-cumulus cell interactions

2.3. Melhoramento do Potencial de Desenvolvimento do Oócito Usando Fatores de Crescimento Exógenos