Nesta etapa do procedimento experimental, produziram-se biofilmes constituidos por 1 isolado bacteriano ( dos 3 isolados resistentes). De seguida apresentam-se os resultados dos ensaios feitos com o biocida cloreto de benzalcónio nos biofilmes referidos. A interpretação dos resultados baseou-se na observação de presença (+) ou ausência (-) de desenvolvimento bacteriano, após sementeira das células dos biofilmes dos tubos de ensaio para caixas de Petri. Neste ensaio todos os biofilmes foram sujeitos à ação do biocida durante 24 horas. A tabela 11 representa os resultados obtidos neste ensaio.
Tabela 11: Concentrações mínimas bactericidas de cloreto de benzalcónio obtidas para os isolados de P. aeruginosa, E. coli e S. Typhimurium, em biofilmes constituídos por um isolado bacteriano, com presença (+) ou ausência( -) de desenvolvimento bacteriano
Isolado bacteriano presente no biofilme Concentrações (µg/mL) Controlo Concentração mínima bactericida (µg/mL) 1 2 3 4 5 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Pseudomonas aeruginosa N / A N/ A N/ A N/ A N/ A - + - + + - N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A + 19 Escherichia coli N / A N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A - - - - - - + 1 Salmonella Typhimurium + - - - - N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A N/ A + 1 N/A-Não aplicável
No biofilme constituído pelo isolado de P. aeruginosa, este foi sujeita às concentrações de 15,16, 17, 18, 19 e 20 µg/mL. P. aeruginosa apenas se desenvolveu a 16,18 e 19 µg/mL. Como tal, a CMB obtida para este isolado foi 19 µg/mL, um valor 3.8 vezes superior ao valor de CMI obtido para a sua forma plantónica.
No biofilme constituído pelo isolado de E. coli, este foi sujeita às concentrações de 20, 21, 22, 23, 24 e 25 µg/mL. E. coli não se desenvolveu em nenhuma concentração testada, por isso considerou-se 1 µg/mL como sendo a sua CMB, valor igual ao valor de CMI obtido para a sua forma plantónica.
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No biofilme constituído pela espécie de S. Typhimurium, este foi sujeita às concentrações de 1, 2, 3, 4 e 5 µg/mL. S. Typhimurium só cresceu a 1 µg/mL, considerando-se essa a CMB, mantendo-se este valor igual ao valor de CMI obtido para a sua forma plantónica.
O biocida cloreto de benzalcónio manteve a sua eficácia a uma concentração de 1 µg/mL contra os isolados de S. Typhimurium e E. coli em biofilme, ao passo que no caso de P.
aeruginosa, apenas foi eficaz a 20 µg/mL.
Como se pode verificar, o isolado de P.saeruginosa foi o único cujo valor de CMB aumentou em biofilme, comparativamente com a CMB obtida na sua forma plantónica. Já vários estudos demonstraram que os biofilmes constituídos pela espécie de P. aeruginosa têm uma resistência elevada a muitos antimicrobianos, sendo que esses estudos indicam que esta resistência se deve em grande parte ao exopolissacarídeo alginato, que é sintetizado pela espécie de P. aeruginosa e que exerece um efeito protetor considerável contra agentes antimicrobianos (Hentzer et al., 2001; Leid et al., 2005; Cotton, Graham & Lee, 2009). Os resultados obtidos neste ensaio permitem observar que para o caso dos isolados de S. Typhimurium e E. coli, o facto destas se encontrarem em biofilme não altera a sua susceptiblidade ao desinfetante cloreto de benzalcónio, sendo este igualmente eficaz contra essas espécies quer estas se encontrem na sua forma plantónica ou em biofilme.
Analisando os resultados deste ensaio e do ensaio anterior, deduz-se que o isolado de P.
aeruginosa foi o microrganismo que contribuiu para que os isolados de S. Typhimurium e E. coli se tornassem menos suscetíveis ao biocida quando estas se encontravam incluídas em
biofilmes multiespécies, uma vez que na ausência do isolado de P. aeruginosa, tanto os isolados de S.Typhimurium como E.coli tiveram um valor de CMB igual ao CMI obtido para as suas formas plantónicas.
Neste ensaio surgiram novamente alguns resultados inconsistentes, nomeadamente o facto do isolado de P. aeruginosa não se ter desenvolvido a 15 e a 17 µg/mL, mas ter-se desenvolvido a 16, 18 e 19 µg/mL . Estes resultados podem ser devido ao facto da metodologia adotada não ser a mais adequada na preservação de biofilmes, uma vez que as ações mecânicas às quais os biofilmes eram sujeitos neste procedimento experimental podem ter comprometido a integridade dos mesmos, reduzindo o número de células presentes, o que justificaria os resultados negativos obtidos nas concentrações de 15 e 17 µg/mL para o isolado de P. aeruginosa.
62
Conclusões gerais
No presente trabalho experimental, foi feito o estudo da eficácia do biocida cloreto de benzalcónio através da determinação de concentrações mínimas inibitórias e bactericidas desse composto nos isolados bacterianos de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,
Salmonella Typhimurium, Bacillus cereus e Staphylococcus spp., na sua forma plantónica e
em biofilmes. Os objetivos propostos à realização do procedimento experimental foram atingidos, retirando-se as seguintes conclusões:
Na forma plantónica de cada isolado bacteriano, o biocida cloreto de benzalcónio é mais eficaz em isolados de bactérias Gram-positivas, uma vez que se obtiveram valores inferiores de CMI para essas espécies, em comparação com os valores de CMI obtidos para as bactérias Gram-negativas
O biocida cloreto de benzalcónio é menos eficaz em todos os isolados bacterianos quando estas se encontram em biofilmes multiespécies, continuando no entanto a apresentar maior eficácia contra as bactérias Gram-positivas, uma vez que os valores de CMB obtidas para essas espécies foram inferiores aos de CMB obtidos para as bactérias Gram-negativas
O isolado de P.aeruginosa foi o que contribuiu para uma maior resistência dos outros isolados bacterianos ao biocida, quando se encontram em biofilmes multiespécies, uma vez que na sua ausência, as outras espécies bacterianas mantiveram um valor de CMB igual ao valor de CMI obtido para as suas formas plantónicas
O procedimento experimental adotado foi adequado à realização do estudo proposto, possuindo no entanto limitações que se traduziram na obtenção de alguns resultados inconsistentes
Atualmente ainda não existem muitos estudos que avaliem a eficácia de biocidas através da determinação de CMB em biofilmes constituídos por várias espécies microbianas. Por outro lado, a natureza variada dos biofilmes traduz-se numa dificuldade em prever os resultados da sua interação com biocidas. Assim sendo, justifica-se o desenvolvimento de protocolos que permitam fazer estudos de eficácia de biocidas em biofilmes, de modo a aprofundar os conhecimentos nesta área.
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Anexos
Anexo I- Protocolo no qual se baseou o presente estudo de eficácia do biocida cloreto de benzalcónio em biofilmes