1. Coleta do Material
As preparações citológicas para os estudos citogenéticos foram obtidas no campo, em laboratórios improvisados, utilizando-se uma centrifuga manual (Figura 2). Após o sacrifício do animal, a medula óssea foi retirada e processada até a etapa de fixação. A suspensão celular foi, então, mantida no gelo ou em freezer, quando possível, até ser trazida ao laboratório para a feitura das lâminas. Nas coletas realizadas, nos municípios de Porto Nacional e Formoso do Araguaia, foram feitas preparações citológicas diretas de medula óssea, após tratamento de colchicina in vivo. Nas demais coletas, foi empregada a técnica de obtenção de preparação citológica a partir de medula óssea, com tratamento de colchicina e brometo de etídio in vitro.
1.1. Preparações diretas de medula óssea, com tratamento de colchicina in vivo
A técnica de preparações diretas de medula óssea é a baseada no trabalho de BAKER et al. (1982), com modificações, de acordo o roteiro abaixo.
a. Anestesiar o animal com éter e injetar intraperitonealmente uma solução de colchicina a 0,1% na proporção de 1 ml para cada 100g de peso corporal.
Figura 2. Um dos laboratórios de campo, na Fazenda Vicentão em Couto Magalhães, TO.
b. Após 1 hora, sacrificar o animal com éter ou clorofórmio.
c. Retirar o fêmur, limpar cuidadosamente os restos de músculos e cortar as epífises.
d. Com o auxílio de uma seringa, transferir a medula óssea para um tubo de centrífuga, lavando o canal ósseo, com solução hipotônica de cloreto de potássio 0,075 M.
e. Ressuspender o material, pipetando suavemente com pipeta Pasteur e deixar em repouso por, no mínimo, 20 minutos à temperatura ambiente (acima de 25oC).
f. Centrifugar o material entre 800 e 1000 RPM por 6 minutos e retirar o sobrenadante.
g. Ressuspender o sedimento e proceder a fixação adicionando lentamente o fixador Carnoy, preparado com metanol e ácido acético, na proporção 3:1. Centrifugar e
trocar o fixador pelo menos 3 vezes. Ressuspender sempre o material antes de cada troca de fixador.
h. Para preparação das lâminas, pingar uma ou duas gotas da suspensão celular sobre uma lâmina mantida horizontalmente sobre um suporte de arame, colocado em banho-maria a 60ºC. Em seguida, retirar a lâmina do banho-maria e deixar secá-la ao ar.
1.2. Preparações diretas de medula óssea, com tratamento de colchicina e brometo de etídio in vitro
A técnica de preparação direta de medula óssea, com tratamento de colchicina e brometo de etídio in vitro, baseou-se nos procedimentos adotados pela Divisão de Genética, Coordenadoria de Pesquisa do INCA, de acordo com o roteiro abaixo.
a. Sacrificar o animal com éter ou clorofórmio. Retirar o fêmur, limpar cuidadosamente todos os restos de músculos e cortar as epífises.
b. Com o auxílio de uma seringa, transferir a medula óssea para um tubo de centrifuga contendo o meio de cultura RPMI 1640, 20% de soro bovino fetal e colchicina na concentração final de 0,5 x 10-6M, lavando o canal ósseo.
c. Acrescentar brometo 0,1 ml de etídio na concentração final (5µg/ml) ao tubo centrifuga e deixar por 2 horas a 37oC. Essa substância é empregada para distender os cromossomos.
d. Centrifugar o material entre 800 e 1000 RPM por 6 minutos e retirar o sobrenadante. Colocar solução hipotônica de cloreto de potássio 0,075 M, homogeneizar e deixar em repouso por 30 minutos à temperatura ambiente (acima de 25°C).
e. Fazer a pré-fixação colocando de 1 a 2 ml de fixador Carnoy no tubo de centrifuga. Inverter o tubo para homogeneizar a suspensão e deixar por 3 minutos em repouso.
f. Centrifugar, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em fixador Carnoy. Centrifugar e trocar o fixador pelo menos 3 vezes, antes da preparação das lâminas, seguindo o descrito no item 1.1.
2. Coloração Convencional e Diferencial
2.1. Coloração convencional
a. Incubar a lâmina em ácido clorídrico 1N aquecido a 60oC, por 5 a 10 minutos, e em seguida, lavar em água destilada.
b. Corar com solução de Giemsa, preparada com 1 ml da solução comercial (Merck) e 29 ml de tampão fosfato, 0,1M, pH 6,8, durante 10 minutos.
c. Lavar em água destilada e secar.
2.2. Banda G
A técnica de obtenção da banda G foi baseada em SEABRIGTH (1971), de acordo com os seguintes passos.
a. Fazer sobre a lâmina um filme de solução de tripsina a 0,5% (250 mg/50 ml), preparada com solução de cloreto de sódio a 0,85%, e deixar de 10 segundos a 2 minutos. A solução de tripsina foi aquecida previamente a 37oC.
b. Lavar a lâmina em água destilada.
c. Corar com solução de Giemsa (ver coloração convencional), durante 10 minutos.
d. Lavar em água destilada e secar.
2.3. Banda induzida por brometo de etídio
As preparações citológicas obtidas a partir da medula óssea tratada com brometo de etídio apresentaram, após procedimento de coloração convencional pelo Giemsa, uma diferenciação longitudinal em bandas, cujos padrões são semelhantes aos de banda G obtidos com tripsina. Em alguns casos, as lâminas passaram previamente pelo tratamento usual com tripsina, seguindo os passos descritos acima para obtenção das bandas G.
2.4. Banda C
A técnica de obtenção de banda C (heterocromatina constitutiva) é a de SUMNER (1972), com modificações.
a. Incubar a lâmina em solução de ácido clorídrico 0,2N por 30 minutos à temperatura ambiente. Lavar em água destilada.
b. Incubar a lâmina em solução de hidróxido de bário octahidratado a 5%, em banho-maria a 60oC, por 1 a 3 minutos. Lavar em água destilada.
c. Mergulhar rapidamente a lâmina em solução de ácido clorídrico 1N, a 60oC, e lavar em água destilada.
d. Incubar a lâmina em solução salina de 2 x SSC, pH 7,0, a 60ºC e deixar por 1 hora.
e. Lavar a lâmina em água destilada.
f. Corar a lâmina com solução de Giemsa preparada com 2 ml da solução comercial (Merck) e 28 ml de tampão fosfato 0,1M, pH 6,8, durante 20 a 30 minutos.
g. Lavar em água destilada e secar.
2.5. Regiões Organizadoras de Nucleólos
Para as marcações das RONs (Regiões Organizadoras de Nucléolos), foi seguida a técnica de HOWELL e BLACK (1980), com modificações.
a. Incubar a lâmina em solução de ácido clorídrico 1N, a 60oC, durante 3 minutos. Deixar secar a lâmina.
b. Pingar sobre o material, 1 gota de solução de coloidal reveladora (1 g de gelatina em 50 ml de água destilada mais 0,5 ml de ácido fórmico) e, em seguida, 2 gotas de solução de nitrato de prata a 50%.
c. Cobrir a lâmina com lamínula e incubá-la em câmara úmida, a 60oC, durante 3 minutos.
d. Lavar a lâmina em água destilada e corar em solução de Giemsa (ver coloração convencional), durante 30 segundos. Lavar em água destilada e secar.
3. Análise das Preparações Cromossômicas
De cada exemplar foi analisada ao microscópio óptico uma amostra de células em metáfases, com diferentes técnicas de coloração para se estabelecer o número diplóide (2n) modal da espécie e o número de braços autossômicos (NA). A classificação morfológica dos cromossomos foi feita visualmente, como metacêntrico, submetacêntrico, subtelocêntrico e acrocêntrico. Em caso de dúvida, sobre a forma de algum cromossomo, os procedimentos foram os mesmos utilizados por LANGGUTH e LIMA (1988), porém adaptados de e acordo a nossa classificação adotada e citada acima.
As melhores metáfases foram fotografadas no fotomicroscópio ZEISS, com objetiva 100 de imersão, optovar 1,25 e filtro verde. Os filmes empregados foram o AGFA Copex Pan A.H.U. (Agfa-Gevaert), revelado em Dektol, diluído 1:1 em água destilada, à temperatura de 18oC, durante 6 minutos e o Technical Pan Estar A. H. (Kodak) revelado em D19 puro, à temperatura de 20oC, durante 3 minutos. As cópias fotográficas foram feitas em papel Kodabrome Print RC-F3 (Kodak) e revelados em Dektol, diluído em água, na proporção de 1:2.