Limitations and suggestions for further research

A busca em estabelecer as rotas bioquímicas secundárias da BH ruminal tem recebido atenção especial do meio científico nos últimos anos. Estudos in vivo da digesta de caprinos e bovinos têm revelado extensa gama de isômeros de CLA e C18:1 trans anteriormente desconhecida, e sugerem que muitas outras rotas de intermediários ainda necessitam ser estudadas. Os itens a seguir – 6.1 a 6.4 – apresentam as últimas descobertas relativas aos AG intermediários da BH dos ácidos oleico, vacênico, linoleico e linolênico.

6.1. Ácido oleico

A BH do ácido oleico é frequentemente apresentada como um passo único e direto para a formação do ácido esteárico, sem que haja qualquer intermediário. No entanto, Jenkins et al. (2006) mostraram que é muito comum a ocorrência de isomerização cis ou trans (cis/trans) desse AG, influenciada pela presença de diferentes espécies de bactérias no ambiente ruminal. Esses autores propuseram que a rota de BH do ácido oleico pode ocorrer tanto diretamente para o ácido esteárico como para formar AG intermediários com cadeias oxigenadas (10-OH 18:0 e 10-O 18:0) e com duplas ligações entre os carbonos 6 e 16 da cadeia carbônica (Figura 8). Essa teoria é reforçada pelo fato de que vacas leiteiras alimentadas com dietas ricas em ácido oleico tendem a secretar leite com maiores teores de AG C18:1 trans (Selner e Schultz, 1980).

42 Segundo Doreau et al. (2009), estudos in vitro indicam que o grau de BH ruminal do ácido oleico é inferior ao dos ácidos linoleico e α-linolênico (Tópico 4.2), variando entre 58 e 87%.

Figura 8. Rotas metabólicas de bio-hidrogenação do ácido oleico. Fonte: Shingfield et al. (2010).

Algumas espécies de bactérias são capazes de alterar a configuração cis dos seus AG de membrana para a configuração trans. Elas lançam mão desse engenhoso artifício com o objetivo de reduzirem a permeabilidade das suas membranas celulares agindo, assim, como dispositivo de proteção contra substâncias inibidoras do crescimento ou outras injúrias externas (Okuyama et al., 1991 citados por Jenkins et al., 2008).

Kemp et al. (1975) observaram que algumas bactérias do gênero Fusocillus eram capazes de converter ácido oleico a C18:1 trans. Esta conversão foi estudada mais recentemente por Mosley et al. (2006), usando ácido oleico marcado com 13C incubado in vitro em culturas de bactérias ruminais. A incubação resultou na detecção do 13C tanto em moléculas de ácido esteárico como em vários tipos de isômeros C18:1 trans com duplas ligações entre os carbonos 6 a 16.

Estudos adicionais demonstraram que a isomerização do ácido oleico pode ser drasticamente alterada pelas condições ruminais. Abu-Ghazaleh et al. (2005) verificaram que tanto a redução do pH – de 6,5 para 5,5 – como o incremento na taxa de passagem da fase líquida – de 5 para 10% - de um meio de cultura de fluxo contínuo inibiram a formação de duplas ligações em posições inferiores ao do carbono 10.

6.2. Ácido vacênico

Durante o processo de BH do ácido vacênico, o principal AG C18:1 trans encontrado no rúmen, ocorre a formação de diversos isômeros intermediários cis/trans da mesma forma que se dá com o ácido oleico (Laverroux et al., 2011). Esses autores coletaram líquido de rúmen de animais adaptados com duas dietas: rica em grãos (40% de volumoso + 60% de concentrado); e rica em volumoso (100% de volumoso). Ao líquido ruminal foi adicionado ácido vacênico marcado com 13C e, após 0, 5 e 24 horas de incubação in vitro, quantificou-se a síntese de AG contendo esse isótopo na cadeia carbônica. Os autores encontraram 13C não só no ácido esteárico, mas em todos os isômeros C18:1 cis e trans identificados em cromatografia gasosa (cis-7 a cis-14 e trans-6 a trans-16). Desde as 5 h pós-incubação já foi possível verificar intensa taxa de isomerização. As quantidades de 13C encontradas nas cadeias carbônicas mostraram que 95% do ácido vacênico adicionado nas culturas foi saturado durante as primeiras 5 horas de incubação em líquido ruminal vindo da dieta rica em grão, contra 78% daquele originado da dieta rica em volumoso, não havendo diferença entre tratamentos após 24 horas de incubação.

Os resultados sugerem que o incremento da relação volumoso:concentrado permite elevar a taxa de isomerização e reduzir a de saturação do ácido vacênico, permitindo, assim, a formação de variada gama de isômeros cis/trans.

43 6.3. Ácido linoleico

O conhecimento sobre as rotas de hidrogenação do ácido linoleico permaneceu inalterado até bem recentemente. Ainda em 2007, Ribeiro et al. propuseram que a conversão desse AG em ácido esteárico produzia apenas dois intermediários – CLA cis-9 trans-11 e C18:1 trans-11. No entanto, hoje já se sabe que existe uma vasta gama de intermediários do ácido linoleico no conteúdo ruminal e, consequentemente, na carne e no leite de ruminantes (Shingfield et al., 2010) (Figura 9).

Figura 9. Rotas metabólicas de bio-hidrogenação do ácido linoleico. Fonte: Shingfield et al. (2010). Vários estudos in vivo e in situ relataram a existência de isômeros de CLA com duplas ligações variando entre C7 e C9 a C12 e C14 (Tabela 7). Na maioria dos trabalhos, o isômero cis-9 trans-11 foi o mais prevalente no conteúdo ruminal de bovinos, sendo o único passível de identificação por meio das antigas técnicas de análise cromatográfica. A disponibilização de colunas mais longas – 100 m ou mais – para o cromatógrafo gasoso, somado a novas técnicas de espectroscopia de massa tornou possível a separação e a identificação de isômeros de CLA secundários (Jenkins et al., 2008).

Tabela 7. Referências de trabalhos que identificaram isômeros do ácido linoleico conjugado (CLA) no conteúdo ruminal, de acordo com a posição e a geometria das duplas ligações. Adaptado de Jenkins et al. (2008)

Posição das insaturações cis / cis cis / trans trans / cis trans / trans

7, 9 a a b 8, 10 a e a b d 9, 11 c d e a b c d e a b d 10, 12 e a b c d e a b d 11, 13 d a b d e a b e a b c d e 12,14 b

a = Piperova et al. (2002); b = Shingfield et al. (2003); c = Loor et al. (2002a); d = Duckett et al. (2002); e = Loor et al. (2004).

O isômero de CLA trans-10 cis-12 vem chamando a atenção nos últimos tempos tanto por sua concentração como pela ação sobre a fisiologia da fêmea ruminante em lactação. Kim et al. (2002) e Ando et al. (2004) demonstraram que algumas linhagens de bactérias Megasphaera, Bifidobacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus e Lactobacillus eram capazes de produzir quantidades significativas desse isômero. Esses gêneros ocorrem no rúmen em baixas concentrações e, principalmente, sob condição de baixo pH ruminal. Isso explica a origem das rotas metabólicas apresentadas anteriormente na Figura 5.

6.4. Ácido linolênico

Poucos estudos se dispuseram a analisar os isômeros do ácido linolênico presentes no conteúdo ruminal, dificultando, assim, a descoberta de novos intermediários e a expansão do conhecimento das possíveis rotas de BH (Jenkins et al., 2008). A recente descoberta da existência de inúmeros intermediários C18:1, C18:2 e

C18:3 originados da BH do ácido α-linolênico (sumarizada na Figura 10) indica que as rotas metabólicas

sugeridas atualmente para descrever a BH apresentam, na verdade, apenas uma pequena fração de todos os intermediários que realmente são formados no rúmen (Shingfield et al., 2010).

44 Figura 10. Rotas metabólicas de bio-hidrogenação do ácido α-linolênico. Fonte: Shingfield et al. (2010). Estudando o fluxo duodenal de vacas em lactação alimentadas com dietas convencionais, Loor et al. (2004) observaram a presença dos isômeros C18:3 cis-9 trans-12 cis-15, cis-9 trans-12 trans-15 e trans-9 trans-12 trans-15. Ao adicionarem óleo de linhaça – importante fonte de ácido α-linolênico - na dieta, esses autores reportaram aumento (P<0,05) considerável (+45%) na concentração desses três AG.

Destaillats et al. (2005) observaram que dois AG linolênicos conjugados (C18:3 cis-9 trans-11 cis-15 e C18:3 cis-9 trans-13 cis-15) estavam presentes em concentrações razoáveis (0,3%) em todas as amostras de gordura do leite de vacas por eles analisadas. Os autores propuseram que ambos os isômeros seriam os intermediários iniciais da BH do ácido linolênico e que seriam subsequentemente reduzidos a dois dienos não conjugados (C18:2 trans-11 cis-15 e C18:2 cis-9 trans-13) e dois dienos conjugados (CLA cis-9 trans- 11 e CLA trans-13 cis-15).

Nessa mesma linha de pesquisa, Wasowska et al. (2006) apresentaram rota alternativa de BH do ácido linolênico onde, segundo eles, somente seria possível a formação de dois isômeros C18:3 (cis-9 trans-11 cis-15 e trans-9 trans-11 cis-15) e um C18:2 não conjugado (trans-11 cis-15), mas não seria possível a formação de C18:2 conjugados.

Mais recentemente, essa teoria foi questionada por Lee e Jenkins (2011). Os autores adicionaram ácido α- linolênico (C18:3 cis-9 cis-12 cis-15) marcado com o isótopo 13C em amostras de líquido ruminal (pH 6,5) e avaliaram a velocidade de desaparecimento desse AG e a formação de novos AG contendo esse isótopo na cadeia carbônica. Após 48 h de incubação in vitro, observaram aumento na concentração de oito isômeros de CLA contendo 13C. Os isômeros de CLA com maiores elevações na concentração foram o CLA cis-12 cis-10; CLA cis-9 cis-11 e CLA trans-8 trans-10, com elevações de 21,7%; 20,1% e 21,1%, respectivamente. Os cinco isômeros restantes, incluindo o CLA cis-9 trans-11, apresentaram elevação média de 15% nas suas concentrações. Observou-se também aumento na concentração de grande variedade de AG C18:2 e C18:3 não conjugados e parcialmente conjugados.

Diante da complexidade e das incertezas observadas, percebe-se que ainda há muito que se pesquisar sobre as rotas da BH do ácido linolênico no rúmen.