A tabela 11 mostra os resultados obtidos no estudo da estabilidade química da lumefantrina (item 4.9.2.8). Foi observado que, durante 70 dias, as amostras mantidas a temperatura ambiente, não apresentaram perda superior a 15%.
TABELA 11: Estudo da estabilidade da lumefantrina Concentração de lumefantrina (ng/mL) n Tempo 0 (relação de área) 70 dias depois (relação de área) Perda de lumefantrina (%) Coeficiente de variação (%) 160 3 0,285 0,225 21,05 8,98 640 3 0,256 0,204 20,31 8,27 1440 3 0,287 0,223 22,30 13,70 n= número de determinações 5.2.9 Robustez
Para avaliação da robustez do procedimento foram variados o pH da fase móvel em 5,1 e 3,5 , a concentração de acetonitrila, nas proporções de 70:30 (v/v) e 60:40 (v/v) e o fluxo da fase móvel em 1,2; 1; 0,8; 0,6 e 0,5 . Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 12.
5.2.10 Aplicabilidade do método
O resultado da análise da concentração de lumefantrina em sangue total adsorvido
em papel de filtro dos pacientes com malária falciparum em tratamento com Coartem®,
coletado no D3, submetidos ao método validado, está representado na tabela 13 e figura 16.
TABELA 12: Avaliação da robustez do método através de alterações no valor de pH, fluxo e na proporção dos solventes da fase móvel, de acordo com as condições cromatográficas previamente padronizadas.
Variação Tempo de Retenção (min)
n Lumefantrina PI ACN/água (70:30) pH=5,1; fluxo de 1mL/min. 5 6,7 7,6 ACN/água (70:30) pH=5,1; fluxo de 0,8mL/min. 5 9,2 10,1 ACN/água (60:40) pH=5,1; fluxo de 1mL/min. 5 5,5 6,1 ACN/água (60:40) pH=5,1; fluxo de 0,6mL/min. 5 9,4 10,5 ACN/água (60:40) pH=3,5; fluxo de 0,5mL/min. 5 12,4 12,2 ACN/água (60:40) pH=3,5; fluxo de 0,8mL/min. 5 14 19,7 ACN/água (60:40) pH=3,5; fluxo de 1mL/min. 5 12,1 17,5 n= número de determinações
TABELA 13: Concentrações (ng/mL) de lumefantrina em pacientes com malária falciparum Paciente n Concentração lumefantrina
(ng/mL) 1 3 785 2 3 1118 n= número de determinações
FIGURA 16: Cromatograma de amostra de sangue total de paciente com malária
falciparum em tratamento com Coartem®. LF(A) e LFac (B).
A
6. DISCUSSÃO
É fundamental que os laboratórios analíticos disponham de meios e critérios objetivos para demonstrar, através da validação, que os métodos de ensaios que executam conduzem a resultados confiáveis e adequados à qualidade pretendida. Se um método existente for modificado para atender aos requisitos específicos, ou um método totalmente novo for desenvolvido, o laboratório deve se assegurar de que suas características de desempenho atendem aos requisitos para as operações analíticas pretendidas. (INMETRO, 2003).
A importância da validação em análise química tornou-se mais acentuada a partir da constatação, na década de 1970, da enorme variabilidade dos resultados de análise toxicológica de amostras submetidas a estudos interlaboratoriais por órgãos do governo americano. A partir de iniciativas de instituições do governo americano, tais como o Food and Drug
Administration (FDA) e a Environmental Protection Agency (EPA), e dos resultados de
estudos para assegurar a integridade dos dados laboratoriais, criou-se o sistema denominado ISSO/IEC-25. (CHASIN; CHASIN; SALVADORI, 1994), objetivando a padronização das exigências a serem seguidas pelos laboratórios a fim de garantirem competência na realização dos serviços, assim como tornarem os resultados internacionalmente aceitos e passíveis de serem reproduzidos em outros laboratórios. A partir destas normas, cada país estabelece seu próprio programa para assegurar a qualidade. (LANÇAS, 2009).
No Brasil, há duas agências para verificar a competência dos laboratórios de ensaios, a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e o INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial). Estes órgãos disponibilizam guias para o procedimento de validação dos métodos analíticos. A regulamentação é
apresentada na resolução n° 899, da ANVISA, a qual é baseada no guia proposto pelo FDA (Guidance for industry. Bioanalitical Method Validation).
Artigos envolvendo determinação de LF nos fluídos biológicos são escassos, principalmente aqueles que envolvem o papel de filtro como suporte, até o momento apenas dois artigos se encontrou em todo o mundo: Blessborn et al. (2007) e Ntale et al. (2008). Os que utilizam plasma humano também possuem carência de publicações, apenas cinco: Zeng et al. (1996); Mansor et al. (1996); Annerberg et al. (2005); Lindegardh et al. (2005); Huang et al. (2010). Isto é preocupante, pois a lumefantrina em combinação com arteméter está sendo utilizada em muitos países onde a malária é endêmica e onde há presença de resistência aos outros antimaláricos (WHITE, 2004).
Com a introdução do Coartem® como terapia de primeira linha para o tratamento da malária falciparum no Brasil, torna-se imprescindível a validação de um método que determine a concentração da LF em fluídos biológicos humanos, tal como plasma e sangue total. Este foi um dos motivos que impulsionou o planejamento deste trabalho, assim como a carência de um método eficiente e de baixo custo para a monitorização terapêutica deste fármaco.
Ao considerar que para a validação analítica é necessário conhecer o processo que envolve as diversas etapas metodológicas, portanto, foram seguidas neste estudo as recomendações sugeridas por Leite (2002), quer sejam: conhecer a substância a ser analisada e a amostra, o melhor sinal analítico, o modo ideal para conservação das soluções padrões e amostras e definição das condições analíticas através do conhecimento dos dados disponibilizados na literatura.
Além disso, estudos para determinar os parâmetros de desempenho analítico devem ser realizados com equipamentos e instrumentos operando de acordo com as especificações do fabricante e devidamente calibrados. Da mesma forma, o operador que realiza os estudos deve ter competência nesta área do conhecimento e ser capaz de tomar as decisões apropriadas durante a realização do trabalho. (HARTMANN et al., 1998; INMETRO, 2003).
No presente trabalho, o método validado para determinação de lumefantrina
utilizou equipamento de baixo custo operacional (CLAE) disponível em boa parte dos laboratórios dos países em desenvolvimento como o Brasil. Além disso, possui como vantagens o tempo reduzido de análise, alta resolução, seletividade, sensibilidade versatilidade e possibilidade de automatização. (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
As condições para análise cromatográficas foram estabelecidas em função das características dos grupos funcionais da LF e da matriz biológica usada, uma vez que a complexidade desta é a questão principal na validação de um método bioanalítico. O desenvolvimento do método se iniciou com a escolha de um sistema cromatográfico capaz de separar o fármaco em tempo mais reduzido possível. (HENDRIKS, 2009).
O detector de ultravioleta (UV) foi escolhido por ser o mais adequado a detecção da estrutura química da LF, em comprimento de onda de 335nm (Tabela 02). Além disso, considerou-se o baixo custo e a simplicidade na detecção. (CIOLA, 1998). A coluna C18 em fase reversa foi escolhida devida suas características apolares (sílica ligada a um grupo octadecil), ter sido utilizada, com sucesso, em alguns dos métodos validados (Zeng et al. (1996); Mansor et al. (1996) e Ntale et al. (2008), além do preço inferior, quando comparada a
(2005); Lindegardh et al. (2005); Blessborn et al. (2007) e Huang et al. (2010) (CIOLA, 1998; LANÇAS, 2009).
Neste estudo, utilizou-se água ultra pura e acetonitrila na composição da fase móvel, a primeira é de fácil acesso e baixo custo; a segunda foi escolhida devida sua baixa polaridade, o que facilitou a eluição do analito em tempo adequado (Tabela 03). Esta fase móvel foi selecionada, também, devido a algumas propriedades físico-químicas importantes: alto grau de pureza, dissolução da amostra sem decompor seus componentes, não decompõe a fase estacionária, baixa viscosidade e ponto de ebulição, é compatível com o detector utilizado e tem miscibilidade completa. (LEITE, 2002; COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
Vários estudos publicados, como os de Mansor et al. (1996), Annerberg et al.
(2005), Lindegardh et al. (2005), Blessborn et al.(2007) e Ntale et al.(2008), utilizaram tampão
na composição da fase móvel (fosfato, percolato ou acetato), a fim de manter o pH constante, reproduzindo o tempo de retenção. Contudo, neste estudo o emprego de fase móvel sem tampão, não acarretou mudança significativa no tempo de retenção do analito e do padrão interno, não prejudicando sua separação e identificação.
Zeng et al.(1996) e Huang et al.(2010) acrescentaram ácidos na fase móvel para reforçar a dissociação do analito nos solventes orgânicos, o que mostrou-se desnecessário neste estudo, pois tanto no preparo da solução estoque de LF, quanto nas extrações utilizou-se ácido acético glacial, e a LF apresentou boa solubilização em acetonitrila, que é o componente majoritário da fase móvel.
Outro ponto importante foi o pH da fase móvel, pois a maioria dos artigos revisados utilizam pH ácido (entre 2,00 a 2,35 ), com exceção de apenas dois: Mansor et al. (1996) (pH=4,9) e Zeng et al. (1996) (pH=4,00). Sabe-se que a sílica da fase estacionária, mesmo estando ligada a grupos como o octadecil, pode ser degradada em pH extremo, e o ideal é entre 3 a 7. (CIOLA, 1998; LEITE, 2002; CÉSAR; PIANETTI, 2009). Neste estudo, optou- se por preservar a coluna utilizando pH=3,5 pois foram obtidos boa resolução dos picos e solubilização do analito na fase móvel, bem como pelo fato da LF ser uma base fraca e fases móveis muito ácidas poderiam ionizá-la, resultando no aparecimento de picos com cauda, pela maior afinidade a fase móvel. (LANÇAS, 2009).
A utilização de padrão interno confere maior reprodutibilidade ao método, pois minimiza as variações que podem ocorrer nas diversas etapas metodológicas, desde a separação e extração até as oscilações do equipamento (detector, coluna, bomba ou vazão). Assim, a identificação dos analitos de interesse por meio do tempo de retenção em relação ao padrão interno, garante maior confiabilidade à análise qualitativa, enquanto a quantificação por meio da relação de áreas dos picos cromatográficos do analito de interesse e do padrão interno assegura maior qualidade dos resultados (RIBANI et. al, 2004).
Alguns estudos utilizaram halofantrina como PI, Mansor et al. (1996), Ntale et al. (2008) e Huang et al. (2010), outros sintetizaram análogos com estruturas químicas similares a da LF, Zeng et al. (1996), Annerberg et al. (2005), Lindegardh et al. (2005) e Blessborn et al. (2007) . Como não foi possível a aquisição da halofantrina, devido ao seu alto custo, optou-se pela síntese de um derivado (lumefantrina acetilada). O cromatograma das soluções padrões (figura 12) mostra que os picos apresentaram boa resolução, corroborando com os trabalhos de Annerberg et al. (2005), Lindegardh et al. (2005), Ntale et al. (2008) e Huang et al. (2010).
Tanto a extração do plasma como do papel de filtro foram baseadas nos estudos de Mansor et al. (1996) e Lindegardh et al. (2005). Vários testes foram conduzidos para otimização das condições de extração, e consequentemente melhor recuperação do analito e do padrão interno. O custo mais baixo e simplicidade na execução foram os pontos principais para a escolha da extração líquido-líquido, além disso, Zeng et al. (1996) e Mansor et al. (1996) obtiveram boas recuperações da LF (92,9% e 96,8% , respectivamente) utilizando este tipo de extração em amostras de plasma. O que foi corroborado pelos resultados obtidos neste estudo, cuja recuperação média da LF nas amostras de plasma em diversas concentrações foi 101,3%. (Tabela 08). Destaca-se que tais resultados são superiores aqueles empregando extração líquido-sólido, como de Annerberg et al. (2005); Lindegardh et al. (2005) e Huang et al. (2010), que obtiveram, respectivamente, as recuperações médias de 84,4%, 88,5% e 86,9%.
Soma-se o fato que os valores de recuperação das diversas concentrações de LF
adicionadas as amostras de plasma neste estudo obedecem as recomendações oficiais vigentes, isto é, entre 80-115% (Tabela 08). (BRASIL/ANVISA, 2003).
A recuperação média das amostras de sangue total adsorvida em papel de filtro foi
de 84,3%, variando de 48 a 120%. Admite-se a ocorrência de contaminação do papel de filtro
na recuperação da concentração de 160ng/mL, fato creditado a coincidência de datas do
preparo do padrão interno e desta amostra controle. Por outro lado, o menor resultado de recuperação obtido, isto é, 48% corrobora aquele de Ntale et al. (2008), único estudo que utiliza papel de filtro e extração líquido-líquido, cujo valor foi 45%.
Na avaliação da seletividade foram considerados potenciais interferentes aqueles fármacos que poderiam ser administrados pelo paciente concomitantemente ou algum tempo antes ou após o uso do Coartem®, como os antipiréticos e antimaláricos, uma vez que nas áreas endêmicas onde os indivíduos são infectados várias vezes em curto intervalo de tempo, aqueles fármacos ou seus metabólitos de meia vida prolongada, como a cloroquina e a mefloquina, ainda poderão estar no organismo do paciente. Os resultados apresentados na tabela 04 demonstraram que não houve interferência dos fármacos avaliado no tempo de retenção do analito e do padrão interno nas condições cromatográficas otimizadas.
O limite de detecção ficou um pouco acima quando comparado aos estudos de Zeng et al. (1996), Mansor et al. (1996); Annerberg et al. (2005) e Lindegardh et al. (2005). Isto se deve a diferença de sensibilidade entre os equipamentos, sem comprometimento da finalidade da análise. Já o limite de quantificação foi de 160ng/mL, caracterizando assim, a
aplicabilidade do procedimento validado, uma vez que concentrações de LF inferiores a 280
ng/mL, já indicariam possibilidade de resistência (Ezzet, Mull e Karbwang (1998); White, Van vugt e Ezzet (1999).
A escolha da faixa de aplicação do método foi baseada nos estudos de
farmacocinética realizados por Ezzet, Mull e Karbwang (1998), White, Van vugt e Ezzet
(1999), Ezzet et al. (2000) e Ashley et al. (2007)(a), os quais demonstraram que as concentrações terapêuticas de LF em pacientes com malária falciparum variaram de 180 a 1567ng/mL. Ressalta-se que alguns fatores interferem nestas concentrações, como: biodisponibilidade após administração via oral, dia após a administração do fármaco no qual o sangue foi coletado e a aderência do paciente a terapia. (NTALE et al., 2008).
A linearidade e a curva de calibração apresentaram baixa dispersão dos pontos experimentais, com relação de áreas diretamente proporcionais a concentração do analito, que foi caracterizado pelo coeficiente de correlação (r) superior a 0,95. (Tabelas 05, 06 e 07 e Figuras 13, 14 e 15).
A precisão dos métodos avaliada a partir do coeficiente de variação apresentou valores adequados, segundo as recomendações vigentes, isto é, inferiores a 15%, tanto para o método em plasma quanto o de sangue total (Tabelas 09 e 10). (FDA, 2001; BRASIL/ANVISA, 2003)
As agencias regulamentadores não exigem a avaliação da estabilidade, por isso alguns estudos não realizaram esta análise, contudo ao se considerar o uso do papel de filtro, como suporte para matriz biológica, torna-se relevante sua avaliação. Os resultados apresentados na tabela 11 indicam perda média do analito de 21,22%, corroborando estudos realizados por Ntale et al. (2008) ao demonstrarem que os “spots” contendo LF foram estáveis por três meses a temperatura ambiente. Já Blessborn et al.(2007), constataram que o analito é estável por quatro meses em papel de filtro tratado com ácido tartárico.
Já nas amostras de plasma não foi avaliado este parâmetro, uma vez que Mansor et al. (1996) estabeleceram que a LF, nesta matriz, pode ser estocada a -80°C por três meses sem degradação significativa. Lindegardh et al. (2005) ampliaram os estudos nas amostras de plasma, demonstrando que o analito era estável a -20°C por até quatro meses, bem como após dois ciclos de congelamento e 24 horas a temperatura ambiente. Hodel et al. (2009), indicaram que a LF em plasma não degradava em temperatura ambiente por até 48 horas. Huang et al. (2010), verificaram que o fármaco é estável no plasma por nove meses a -70°C, e
após três ciclos de congelamento. Já as soluções padrão foram estáveis por nove meses a -20°C e por três dias a 22°C.
Algumas modificações nos parâmetros cromatográficos estabelecidos, como proporções do solvente orgânico, pH e no fluxo da fase móvel, não alteraram significativamente a resolução da LF e do padrão interno (Tabela 12). Indicando assim, robustez adequada do método, característica indispensável para a qualidade analítica (BRITO et al., 2003).
A aplicabilidade do método foi realizada utilizando duas amostras que foram coletadas no D3 de pacientes com malária falciparum que usaram Coartem®. Os resultados foram satisfatórios, pois o método validado demonstrou ser eficaz na identificação e quantificação do analito de interesse (figura 16). As concentrações de LF obtidas (tabela 13) corroboram com Ntale et al. (2008), no qual as concentrações determinadas no D3 foram semelhantes as obtidas neste estudo.
7. CONCLUSÃO
-Foram otimizados os procedimentos de separação e extração líquido-líquido de lumefantrina em amostras de plasma e de sangue total adsorvidas em papel de filtro, os quais se demonstraram adequados de acordo com a recuperação média do analito;
- O padrão interno sintetizado (lumefantrina acetilada) foi adequado aos objetivos propostos;
- Os parâmetros de validação determinados seguem as recomendações do órgão regulamentador no Brasil, indicando a aplicabilidade do procedimento na determinação de lumefantrina em amostras de plasma e sangue total adsorvidas em papel de filtro;
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