5.3 REGULERINGSFORMÅL OG REGULERINGSBESTEMMELSER
5.3.5 Landbruksområder
Este trabalho permitiu a caracterização molecular da população MCAD laboratório do grupo Metabolismo
Da população em estudo, 93,3% 92,9% são de etnia cigana, o que é
permitindo assim calcular um rendimento de 0,926 ou seja cerca de 40 a 70% do rendimento obtido para a forma selvagem.
Análise electroforética por SDS-PAGE a 10% das fracções resultantes da purificação por IMAC da após expressão em E.coli BL21(DE3) com o construct
o Protocolo C para a purificação (ver Materiais e Métodos para mais detalhes). NZY Colour Protein Marker (NZYtech); FT – Flowthrough.
no caso da variante recombinante pG377V a proteína eluída antes e após coloração castanho-alaranjada, o que poderá indiciar o da ligação do cofactor FAD a esta forma mutada do enzima
condições de expressão e purificação utilizadas, o que se poderá reflectir na sua
Determinação da actividade enzimática da hMCADG377V (pETMCAD
A determinação da actividade enzimática da hMCADG377V recombinante
como acima descrito para a forma selvagem. A actividade específica da hMCADwt 0.263 µmol.min-1.mg-1 , ou seja cerca de 27% da actividade da forma selvagem. A baixa actividade dificultou a concretização da caracterização
pesar destes dados serem ainda preliminares e carecerem de confirmação o valor determinado para a actividade residual da forma p.hMCADG377V
aponta a nova mutação c.1205G>T como causa de
SPECTIVAS
caracterização molecular da população MCAD laboratório do grupo Metabolismos e Genética, iMed.UL, FFUL.
93,3% (n=60) são homozigóticos para o alelo G985 , o que é uma característica dos países do Sul da Europa
31 de 0,926 mg/L cultura
urificação por IMAC da
construct pETMCADwt a 30ºC,
o Protocolo C para a purificação (ver Materiais e Métodos para mais detalhes). M –
a proteína eluída antes e após o que poderá indiciar o o enzima e/ou nas , o que se poderá reflectir na sua
pETMCADG377V)
recombinante foi efectuada tal A actividade específica da hMCADwt , ou seja cerca de 27% da actividade da forma caracterização cinética desta pesar destes dados serem ainda preliminares e carecerem de confirmação inferior a 30% da causa de MCADD.
caracterização molecular da população MCADD referenciada ao
são homozigóticos para o alelo G985, dos quais característica dos países do Sul da Europa [35].
32 Tal como já observado em outras populações onde a mutação missense c.985A>G é a mais frequente, também aqui se observou que esta mutação está sempre as sociada ao haplotipo H1, referente aos polimorfismos intragénicos do gene ACADM para os enzimas BamHI (1), PstI (1) e TaqαI (2), podendo este haplotipo surgir também em alelos normais (51%). Os estudos de caracterização dos haplotipos no locus do gene ACADM, permitiram ainda a descoberta de 2 haplotipos, H5 (122) e H6 (212), ainda não descritos.
Dois novos alelos mutantes foram identificados na população de doentes com MCADD estudada, T503 e T1205. Uma potencial associação entre os diferentes haplotipos e as duas novas mutações encontradas neste trabalho deverá ser avaliada.
Apesar de todos os esforços envolvidos na recolha de dados clínicos, epidemológicos e bioquímicos, este estudo não foi conclusivo no sentido do estabelecimento de uma potencial relação genótipo/fenótipo ou fenótipo clínico/fenótipo bioquímico. Não só porque é baixo número de doentes com mutações menos frequentes mas também porque será necessário complementar a informação relativa à população de doentes com dados que contribuam para um melhor conhecimento da população estudada (ex. gravidez, peso`, desenvolvimento cognitivo/social, perfil de acilcarnitinas completo e sintomatologia).
O sistema de expressão heteróloga desenvolvido permitiu a produção de uma forma recombinante da hMCADwt com elevado rendimento e grau de pureza que poderá ser utilizada na caracterização funcional de formas mutantes da hMCADwt como a variante p.G377V. Os dados experimentais obtidos parecem confirmar o efeito causador de doença da mutação c.1205G>T, o que em si não constitui total surpresa, devido à grande proximidade entre o resíduo Gly377 e o resíduo Glu376, este último envolvido juntamente com o anel de flavina do FAD na ligação do substrato ao enzima. Será no entanto fundamental a caracterização cinética e estrutural (ex. perfil de oligomerização e estabilidade) da variante p.G377V para melhor estimar o seu carácter patogénico. Uma vez que a proteína p.G377V não apresentava a cor amarela característica da presença de FAD no enzima será importante a avaliação do conteúdo em cofactor na proteína mutante vs. a forma selvagem. Uma vez que esta proteína é causada por uma mutação identificada num doente em heterozigotia com a mutação mais frequente, será ainda interessante proceder à co-expressão das variantes p.G377V e p.K304E, com vista à avaliação de uma potencial complementação interalélica. Ainda neste contexto, deverá igualmente ser avaliado o papel da mutação silenciosa c.315 A>C identificada em cis com a mutação c.1205G>T.Os dados obtidos poderão contribuir para um melhor conhecimento das bases moleculares subjacentes à MCADD e a longo prazo promover o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para esta doença hereditária do metabolismo.
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