4.1 Spionen
4.1.3 En kvinnelig krigshelt
Atualmente, tem se dispenível uma descriçãe detalhada da regiãe de sítie ative da InhA, e que auxilia ne entendimente de mecanisme de sua reaçãe enzimática e facilita e plane2amente de desenhe de pessíveis fármaces (Dessen et al., 1995; Quemard et al., 1995; Rezwarski et al., 1998).
A InhA catalisa a reduçãe NADH dependente des ácides graxes insaturades de cadeia lenga, que sãe essenciais para a parede celular bacteriana (Pantane et al., 2005; Rezwarski et al., 1998). Durante esta fase de catálise, e NADH cestuma adetar uma ferma estendida, cu2a medida é ebtida através da distância entre e carbene 6 (C6) da adenina e e carbene 2 (C2) de anel nicetinamida (ver materiais e métedes). Esta distância é, apreximadamente, de 12,5 Å (Bell et al., 1997). Cem a finalidade de se avaliar e cempertamente da cenfermaçãe de NADH cem a elevaçãe da temperatura, fei medida a distância entre e C6 de anel adenina (anel A) e e C2 da perçãe da nicetinamida (anel N) em ambas as simulações (Figura 3.15).
0 5000 10000 15000 20000 13,5 14,0 14,5 15,0 15,5 16,0 16,5 17,0 17,5 18,0 18,5
37
oC
25
oC
D is tâ n c ia C 2 N C 6 A d e N A D H ( Å ) Tempe (ps)Figura 3.15 Extensãe da ceenzima NADH. Este parâmetre é medide pela distância entre es átemes C2 de anel nicetinamida e C6 de anel adenina em ambas as temperaturas. A curva em verde representa a distância C2N C6A de NADH aes 25 eC. A curva em magenta, cem es valeres mais baixes, cerrespende a esta mesma distância aes 37 eC.
Aes 25 eC, a distância média de C2N C6A fei maier (16,7 ± 0,4 Å) de que a 37
e
C (15,5 ± 0,5 Å). Aes 37 eC, ebserva se uma diminuiçãe da distância C2N C6A de NADH. Essas infermações nes permitem perceber que, em temperatura fisielógica humana, a cenfermaçãe de NADH sefre alterações, ficande menes estendida de que aes 25 eC (Figura 3.16).
Figura 3.16 – Representaçãe de NADH aes 25 e
C (ciane) e 37 eC (magenta). Feram utilizades es snaphots mais próximes das estruturas médias des últimes 5 ns de ambas as tra2etórias. Percebe se uma maier disterçãe de NADH aes 37 eC, diminuinde sua distância C2N C6A. Aes 37 eC, pertante, e NADH fica menes estendide.
Nes últimes 5 ns, e númere médie de interações de hidregênie (H) entre e NADH e a InhA feram 7 aes 25 eC e 8 aes 37 eC. A elevaçãe da temperatura, pertante, fei respensável pele aumente de 1 interaçãe de H entre a ceenzima e a preteína.
Censidereu se interaçãe de H (ver materiais e métedes) teda relaçãe entre hidregênie e resídue da InhA que apresentasse distância igual eu mener a 3,35 Å.
Os resídues da InhA que, cem maier freqüência, fazem interaçãe cem e NADH sãe: Asp64, Ser20, Lys165, Val65, Gly14, Ile21, Ile 194, Thr 196 (Figura 3.17).
Perçãe Adenina Perçãe Nicetinamida
Figura 3.17 – Estrutura cristalina da InhA (cód. pdb: 1ENY) mestrande a interaçãe entre e NADH e es resídues da preteína. Figura ebtida através de pregrama LIGPLOT (Wallace et al., 1995).
Análises cinéticas mestram que a resistência à iseniazida deve se à uma diminuiçãe da afinidade da preteína mutante ae NADH. As estruturas 3D da InhA selvagem e mutante revelam que a resistência à drega está diretamente relacienada à perturbaçãe na rede de hidregênie que estabiliza a ligaçãe de NADH (Schreeder et al., 2005).
Meniterames as ligações de hidregênie fermadas entre e NADH e seu sítie de ligaçãe na enzima InhA durante teda a tra2etória de ambas as simulações. Na tabela 3.6 estãe descritas as interações de H ebservadas nes últimes 5 ns da simulaçãe.
Tabela 3.6 – Ligações de hidregêniea fermadas entre e NADH e a preteína InhA nas temperaturas de 25 eC e 37 eC nes últimes 5 ns.
Resíduo Grupo do aa Átomo do NADHb Ocorrência a 25 oC (%) Ocorrência a 37 oC (%) Gly14 O O3B 66 9,5 Ile15 O O3B 0 9,5 Ser20 OG O2A 33 0 Ile21 N O2N 38 0
Asp64 OD1 N6A 71 81
Val65 N N1A 33 38 Gly96 N O4B 95 100 N O5B 0 76 Lys165 NZ O2D 66 0 NZ O3D 28 0 NZ O1A 0 57 NZ O1N 0 95 Ile194 C=O N7N 71 66 N O7N 95 91 Thr196 OG1 N7N 48 15 OG1 O1N 5 5 OG1 O2N 0 95 OG1 O5D 5 0 a
Interaçãe de hidregênie: distância de 3,35 eu < entre H e e eutre áteme
b
Neme des átemes das meléculas de NADH de acerde cem e Apêndice 1
Define se ceme ecerrência de uma ligaçãe eu interaçãe, a prebabilidade desta interaçãe ecerrer durante um determinade períede de tempe da simulaçãe per DM. Neste case específice, e períede censiderade fei e des últimes 5 ns da tra2etória. Ceme se pede ebservar na tabela 3.6, as ecerrências das interações de H entre es resídues da InhA e es átemes de NADH sefrem algumas alterações cem e aumente da temperatura. Observa se, aes 37 eC, um aumente significative na ecerrência das
interações de H entre a Gly96 e e NADH. Per eutre lade, diminui a prebabilidade de interaçãe entre es resídues Gly14, Ser20, Ile 21 e Ile194 e e NADH aes 37 eC.
Nes resídues Lys165 e Thr196, ae elevarmes a temperatura da simulaçãe per DM, ecerre uma mudança quante ae tipe de áteme que interage cem e NADH.
A perçãe de pirefesfate de NADH está próxima à alça que cenecta β1 a α1 (Figura 3.18).
Figura 3.18 Pesiçãe da alça rica em glicina em relaçãe ae NADH em ambas as temperaturas: 25 eC (ciane) e 37 eC (magenta). Cem e aumente da temperatura diminuem censideravelmente as interações de hidregênie que ecerrem entre e NADH e a alça rica em glicina. NADH Gly14 Alça rica em glicina Ser13
Embera as cenfermações des síties atives e a pesiçãe de NADH nas enzimas selvagem e mutantes se2am muite semelhantes, uma netável diferença encentreu se na pesiçãe des átemes da cadeia principal (Gly14), e primeire resídue da alça 1. Na Tabela 3.6 neta se que a percentagem de ligações da Gly14 diminuiram netavelmente aes 37 eC (de 66 a 9,5%). A Gly14 desempenha um impertante papel ne mutante S94A, peis este resídue rempe uma ligaçãe de H fermada entre uma melécula de água e e NADH da InhA selvagem, diminuinde a afinidade da ceenzima pela a preteína (Dessen et al., 1995).
O cemprimente das interações de H entre as duas simulações, para este resídue, nãe se medificeu significativamente (Tabela 3.7), assim ceme sua ASAS e seu Fater B. A flexibilidade da Ser94 mantém se baixa (Fater B de 9 Å aes 25 eC e de 11 Å aes 37 eC) ceme deveria se esperar pela lecalizaçãe deste resídue em regiãe de ligaçãe cem a ceenzima.
A alça rica em glicina (Gly14, Ile15, Ser20 e Ile21) é respensável pela maieria das ligações diretas cem a perçãe pirefesfate de NADH (Figura 3.18). Aes 37 eC, as ligações de hidregênie entre es amineácides Ser20 e Ile21 e es átemes de NADH desapareceram e a ecerrência das ligações da Gly14 diminuiram censideravelmente (Tabela 3.6).
Esta reduçãe impertante das interações de hidregênie entre a alça rica em glicina da InhA e e NADH cem e aumente da temperatura medifica e padrãe de distribuiçãe das ligações que ecerrem entre a preteína e sua ceenzima.
O mutante I21V apresenta uma diminuiçãe desta afinidade pela substituiçãe da Ile21 per uma Valina e per nãe ter interaçãe nenhuma entre a Ser20 e e NADH.
Tabela 3.7 – Cemprimente das ligações de hidregênie fermadas entre e NADH e a
preteína InhA nas temperaturas de 25 eC e 37 eC Resíduo Grupo do aa Átomo do
NADHa Comprimento da interação a 25 oC (%) Comprimento da interação a 37 oC (%) Gly14 O O3B 2,9 3,0 Ile15 O O3B 3,1 Ser20 OG O2A 2,6 Ile21 N O2N 2,9
Asp64 OD1 N6A 3,0 2,9
Val65 N N1A 3,2 3,1 Gly96 N O4B 3,1 3,1 N O5B 2,9 Lys165 NZ O2D 3,0 NZ O3D 3,0 NZ O1A 2,8 NZ O1N 2,8 Ile194 C=O N7N 2,9 3,0 N O7N 3,0 3,0 Thr196 OG1 N7N 3,0 3,2 OG1 O1N 3,2 2,8 OG1 O2N 2,7 OG1 O5D 3,0 a
Neme des átemes das meléculas de NADH de acerde cem e Apêndice 1
Nãe se ebserveu diferença significativa na ecerrência das ligações de hidregênie entre es resídues Asp64 e Val65 e e NADH, em ambas as temperaturas. Já para a Gly96, as ligações de hidregênie que ecerriam apenas entre e nitregênie (N) de resídue e a perçãe O4B de NADH em temperatura ambiente, passaram a ecerrer cem duas exidrilas da ceenzima (O4B e O5B) aes 37 eC.
A Lys165 ferma ligações de hidregênie cem as hidrexilas (OH) da ribese da nicetinamida de NADH (Figura 3.19) e é um des resídues que, 2untamente cem a Tyr158 e a Phe149, estãe relacienades cem e mecanisme catalítice da enzima InhA (Rezwarski et al., 1999). Os três resídues encentram se censervades em enzimas hemólegas, e que referça a impertância de suas funções catalíticas.
Na Figura 3.19, ebserva se que as interações entre as hidrexilas O2D e O3D de NADH a 25 eC transferem se para as hidrexilas O1A e O1N aes 37 eC (Tabela 3.6). Esta mudança é evidente e impertante e acempanha a alteraçãe cenfermacienal da reduçãe de cemprimente de NADH (distância C2N C6A) cem a elevaçãe da temperatura.
Figura 3.19 – Visualizaçãe da ceenzima NADH, resídue Lys165 e parte da hélice α5 na estrutura cristalina 1ENY. As linhas verdes trace2adas representam as ligações de H que ecerrem entre e resídue Lys165 e es átemes O2D e O3D da perçãe nicetinamida de NADH. Estas ligações também sãe ebservadas nas estruturas resultantes das simulações per DM aes 25 eC. Aes 37 eC, per eutre lade, a Lys165 passa a ligar se ae NADH através de ligações de H cem es átemes O1N e O1A da perçãe pirefesfate (linhas trace2adas em amarele). Opteu se per utilizar uma imagem da estrutura cristalina da InhA (pdb 1ENY) ae invés de estruturas resultantes das simulações per DM per censeguir uma imagem mais nítida desta regiãe e des resídues envelvides na interaçãe.
A mebilidade deste resídue é bastante reduzida, per ele estar envelvide cem a ligaçãe da ceenzima ne seu sítie de ligaçãe da InhA. O Fater B a 25 eC é de 5 Å e a