Os testes histoquímicos indicaram a presença de compostos de reserva nas células do limbo foliar e da nervura mediana das secções medianas de folhas de P.guineense
crescidas sob os diferentes tratamentos de trocas gasosas (Figura 4). A presença de grãos de amido foi evidenciada somente nas folhas de plantas do tratamento 1M, presente nas células parenquimáticas clorofilianas do mesofilo e da nervura mediana (Figura 4.3 e 4.4). Polissacarídeos e proteínas foram detectados em todos os tratamentos de trocas gasosas, porém, com maior intensidade de coloração no tratamento 1M, sendo detectado principalmente nas paredes celulares e no citoplasma das células do limbo foliar e nervura mediana (Figura 4.9, 4.10, 4.15 e 4.16). Substâncias lipídicas foram evidenciadas pelos testes de Sudan Black B (Figura 4.21-4.24) e Vermelho neutro somente nos tratamentos 1M e 2M, estando presente na constituição da cutícula delgada do limbo foliar e nervura mediana, e nas paredes das cavidades secretoras do limbo foliar no tratamento 1M e da nervura mediana do tratamento 2M. Pectinas foram detectadas na epiderme das células do limbo foliar e nervura mediana de todos os tratamentos de troca gasosa, não havendo uma nítida diferenciação entre os tratamentos (Figura 4.25–4.30).
Figura 4. Estudo histoquímico de secções transversais da porção mediana de folhas de
Psidium guineense (acesso Y93), crescidas in vitro por 110 dias, sob os diferentes níveis de trocas gasosas e irradiância de 41 μmol m.-2 s.-1. SM: Tampas rígidas de polipropileno (TRP) sem membrana [taxa de troca de CO2 (TTCO2): 14 µL L- 1 s-1]; 1M: TRP com uma membrana [TTCO2: 21 µL L-1 s-1]; 2M: TRP com duas membranas [TTCO2: 25 µL L-1 s-1]. Lugol: coloração roxa ou negra, evidenciando amido (3 e 4); Ácido periódico/reagente de Shiff (PAS): coloração magenta, evidenciando polissacarídeos neutros (7-12); Xylidine Ponceau (XP): coloração avermelhada, evidenciando proteínas (13-18); Sudan Black B: coloração negra, evidenciando lipídios totais (21-24); Vermelho de rutênio: coloração rosa, evidenciando pectinas (25-30). Ad: face adaxial da epiderme; Ab: face abaxial da epiderme; Sc: cavidade secretora. Barra = 50µm.
2.3.2.3. Estudos anatômicos de secções de folhas de P.guajava
Para a goiabeira também foram observadas mudanças anatômicas na estrutura foliar das plantas cultivadas in vitro sob os diferentes tratamentos de trocas gasosas. A utilização de tampas com membranas permeáveis a gases ocasionaram diferenças na estrutura celular do limbo foliar e da nervura mediana das folhas de P. guajava comparado ao sistema convencional de cultivo in vitro SM (Figura 5).
No sistema convencional de cultivo, utilizando frascos vedados com tampas SM, observaram-se células epidérmicas uniestratificadas de formato irregular em ambas as faces da folha, mesofilo heterogêneo, dorsiventral, porém, descaracterizado, apresentando vários espaços intercelulares, células de diferentes formatos, parênquima paliçádico uniestratificado e pouco diferenciado do parênquima lacunoso (Figura 5A), como observado acima para P. guineense nestas mesmas condições de cultivo. Entretanto, quando as plantas foram crescidas com membranas permeáveis a gases, as células epidérmicas apresentaram-se mais definidas em ambas as faces da folha, contendo menos espaços intercelulares e maior diferenciação entre o parênquima paliçádico e lacunoso nas células do mesofilo, principalmente nas plantas crescidas sob 2M (Figura 5I).
Nas plantas crescidas sob 1M, foram detectadas desorganização dos parênquimas clorofilianos, assimetria nas células parenquimáticas e espaços intercelulares aparentes, principalmente entre as células do parênquima lacunoso, porém com menor intensidade, comparado ao sistema convencional de cultivo (Figura 5E).
Diferentemente do observado em P. guineense, o tratamento 2M resultou na produção de folhas com melhor arranjamento celular e diferenciação dos parênquimas clorofilianos, apresentando as células do parênquima paliçádico alongadas anticlinalmente, justapostas, com um a dois estratos celulares e com menores espaços intercelulares nas células parenquimáticas clorofilianas, principalmente entre as células do parênquima paliçádico (Figura 5I).
Cavidades secretoras encontraram-se distribuídas ao longo de toda a extensão da lâmina foliar, indistintamente adjacentes às faces adaxial e abaxial, entre as células doparênquima clorofiliano de todos os tratamentos de trocas gasosas (Figura 5A, 5C, 5D, 5E, 5H e 5I).
As folhas foram caracterizadas do tipo anfi-hipoestomática (Figura 5B, 5C, 5F, 5G, 5J e 5K) com estômatos predominantemente do tipo paracítico e encontraram-se
ligeiramente acima do nível das demais células epidérmicas (Figura 5A-5H, 5J e 5K). Observaram-se variações no formato dos estômatos, sendo mais arredondados sob o tratamento SM (Figura 5B e 5C) e à medida que aumentou as TTCO2 tornaram-se mais
elípticos (Figura 5F, 5G, 5J e 5K), como observado em P.guineense.
Na nervura mediana, observou-se no tratamento SM, tamanho reduzido e estrutura diferenciada, com os tecidos de sustentação pouco desenvolvidos (menor formação de células colenquimáticas), exibindo uma organização típica de células e tecidos encontrados em plantas crescidas heterotroficamente (Figura 5D), como observado em P.guineense sob estas mesmas condições de cultivo.
Os feixes vasculares encontraram-se descaracterizados, sem uma nítida distinção do arranjamento e disposição dos feixes e fibras (Figura 5D). Entretanto, o crescimento de plantas de P. guajava sob membranas permeáveis a gases, resultou na produção de folhas com maior nervura mediana, maior grau de organização e diferenciação celular, maior formação de tecidos de suporte, apresentando células dos feixes vasculares melhor organizadas, com arranjo dos feixes vasculares do tipo anficrival de contorno biconvexo no tratamento SM e convexo para os tratamentos 1M e 2M (Figura 5D, 5H e 5L). Foram observadas fibras esclerenquimáticas circundando os feixes vasculares apenas nos tratamentos 1M e 2M (Figura 5H e 5L). Porém, o tratamento 2M resultou em tecidos de suporte e vascular mais desenvolvidos, formando duas a três camadas de colênquima e três a quatro camadas de esclerênquima (Figura 5L).
Figura 5. Cortes transversais da secção mediana (A, D, E, H, I e L) e impressão epidérmica (B, C, F, G, J e K) de folhas Psidium guajava, crescidas in vitro por 110 dias, sob diferentes níveis de trocas gasosas: SM: Tampas rígidas de polipropileno (TRP) sem membrana [taxa de troca de CO2 (TTCO2): 14 µL L-1 s-1]; 1M: TRP com uma membrana [TTCO2: 21 µL L-1 s-1]; 2M: TRP com duas membranas [TTCO2: 25 µL L-1 s-1], sob irradiância de 41 μmol m.-2 s.-1. Ad: face adaxial da epiderme; Ab: face abaxial da epiderme; Cu: cutícula; Pp: parênquima paliçádico; Sp: parênquima lacunoso; Sc: cavidade secretora; Co: colênquima; Fi: feixes vasculares; Xy: xilema; Ph: floema; St: estômato. Barra = 50µm.