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5.4.1. Efeito in vitro da PTX sobre a citotoxicidade (MTT) em células SH-SY5Y expostas a 6-OHDA

A Figura 36 mostra o efeito da PTX sobre a neurotoxicidade induzida pela 6- OHDA 12,5 μg/ml em células SH-SY5Y. Os resultados demonstraram que a adição da 6-OHDA diminuiu em 68,7% a viabilidade celular quando comparada ao controle. A PTX reverteu significativamente o efeito toxico da 6-OHDA em todas as doses testadas (0,1, 1, 10 e 50 μg/ml). A deferoxamina foi usada como controle positivo do experimento e, como esperado, mostrou citoproteção. Estes resultados mostram que, em células SH-SY5Y, a PTX aumentou a viabilidade e protegeu estas células da ação neurotóxica da 6-OHDA (Figura 36).

Figura 36. Efeito da PTX na viabilidade celular no ensaio de MTT em cultura de

CON TROL 6-OH DA 1 2.5 PTX 0.1+6-OH DA 12. 5 PTX1 +6-O HDA 12. 5 PTX 10+6 -OH DA 12. 5 PTX 25+6 -OH DA 12. 5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 a b b b b Ce ll v ia b il li ty ( M T T , S H -S Y 5 Y )

Valores estão expressos como média ± EPM. a.- Controle vs 6-OHDA; b.- 6-OHDA vs PTX 0,1, 6-OHDA vs PTX 1, 6-OHDA vs PTX 10, 6-OHDA vs PTX 25; p< 0,0001;

5.4.2. Efeito da PTX sobre a produção de nitrito em células SH-SY5Y expostas a 6- OHDA

A concentração de nitrito nas células SH-SY5Y é geralmente muito baixo, em condições normais. Entretanto, após a exposição à neurotoxina 6-OHDA, que provoca estresse oxidativo, a liberação de nitrito nas células SH-SY5Y aumenta. No nosso experimento, a 6-OHDA aumentou em mais de 4 vezes a liberação de nitritos em células SH-SY5Y quando comparado com o controle. A PTX reverteu este efeito tóxico em todas as concentrações estudadas (Figura 36).

Figura 37. Efeito da PTX sobre a formação de nitrito em células SH-SY5Y expostas a 6-OHDA 50µM Con trol e 6OH DA 0,01 0,05 1. 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 PTX (g/mL)

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Valores estão expressos como média ± EPM. ***.- 6-OHDA vs todos, p< 0,0001;

6. DISCUSSÃO

O presente trabalho estudou os possíveis efeitos da PTX in vivo em modelo experimental de DP induzida pela injeção unilateral estriatal de 6-OHDA, em ratos e em cultura de células de neuroblastoma humano da linhagem SH-SY5Y, como modelo de DP in vitro.

Evidências mostram que vários modelos animais de DP induzida por neurotoxinas, como é o caso da 6-OHDA, causam alterações motoras que simulam algumas daquelas observadas em pacientes parkinsonianos (IANCU et al., 2005, CARVALHO et al., 2013). Os nossos resultados mostraram alterações comportamentais em ratos após a injeção unilateral de 6-OHDA no estriado, que se manifesta pelo aumento das rotações induzidas por apomorfina. Este comportamento circular é uma consequência da perda de neurônios dopaminérgicos e foi revertido nos grupos lesionados e tratados com PTX, sugerindo um efeito neuroprotetor.

Resultados semelhantes foram observados na atividade locomotora espontânea, onde a PTX reverteu a diminuição deste parâmetro comportamental avaliado no teste do campo aberto. As manifestações motoras da DP são atribuíveis à degeneração dos neurônios dopaminérgicos dentro do SNPC, resultando em esgotamento DA e desarranjos de circuitos neuronais nas regiões-alvo desses neurônios (EXNER et al., 2012). A reversão destas deficiências motoras por PTX favorece o uso de drogas para o tratamento da DP.

Apesar de tradicionalmente a DP ser reconhecida como uma doença do movimento, torna-se cada vez mais evidente a contribuição de alterações não-motoras características, incluindo déficits cognitivos como já dito anteriormente. Mostramos que, no modelo do labirinto aquático por nós utilizado, que avalia a memória espacial e, portanto, a disfunção hipocampal, ocorreram alterações de memória no grupo lesionado por 6-OHDA, com relação ao grupo FO. Contudo, neste teste (talvez inadequado para avaliar alterações de memória, no nosso modelo), a PTX (exceto na dose intermediária) não apresentou efeitos importantes na reversão dos déficits cognitivos. Em modelo de isquemia cerebral, mostrou-se que a administração de PTX melhorou a memória espacial em ratos, avaliada pelo teste do labirinto aquático de Morris, e reduziu os déficits cognitivos relativamente aos animais lesionados e não-tratados (MOVASSAGHI et al., 2011). Tais dados foram semelhantes a outros anteriormente obtidos (BRUNO et al., 2009).

Outro teste comportamental utilizado no presente trabalho foi o do nado forçado que avalia efeitos de drogas antidepressivas. Mostramos que a PTX reduziu, de modo significativo, o aumento do tempo de imobilidade no grupo lesionado e tratado. Esta diminuição é indicativa de efeito antidepressivo da droga. Outros (BAH et al., 2011) mostraram que a PTX reverteu o comportamento depressivo, demonstrada num modelo de enfarte do miocárdio em ratos. A depressão é um dos mais comuns distúrbios neuropsiquiátricos encontrados no PD, e cerca de 40% dos pacientes com doença de Parkinson está deprimido (MENZA, 2010). Sintomas clinicamente significativos de depressão emergem frequentemente, antes dos sintomas motores, persistindo ao longo do curso da doença (GREENER, 2012). Um alvo provável de drogas antidepressivas é o sistema de transdução de sinal de AMPc, porque os tratamentos antidepressivos crônica, mas não aguda upregulate esta cascata intracelular, a vários níveis, o que resulta no aumento da expressão e função do factor de transcrição CREB (NIBUYA et al., 1996, FUJIMAKI et al., 2000). CREB expressão melhorada conduz a uma sobre-regulação de genes alvo específicos, incluindo o BDNF (VAIDYA E DUMAN, 2001). É importante notar que os inibidores da fosfodiesterase, como a PTX, foram mostrados para aumentar o cAMP intracelular (LIANG et al., 1998), o que pode justificar o efeito antidepressivo da droga, como visto no modelo de 6-OHDA utilizado no presente trabalho.

A alteração molecular e bioquímica mais característica da DP é possivelmente a degeneração da via nigroestriatal, que leva à depleção de DA. Nossos resultados mostraram que, nos grupos lesionados com 6-OHDA, o tratamento com PTX reverteu diminuição dos níveis estriatais de DA e de DOPAC, seu principal metabólito cerebral. Em trabalhos anteriores (BRUNO et al., 2009), mostramos que a PTX protege contra a redução dos níveis estriatais de DA e DOPAC, em modelo experimental de isquemia global transitória em ratos e que estes efeitos são possivelmente resultantes das ações anti-TNF-alfa e anti-inflamatória da droga.

Além de reverter as reduções nos níveis estriatais de DA nos animais lesionados, a PTX bloqueou o aumento das concentrações estriatais de glutamato e aumentou os níveis de glicina nestes animais. Sabe-se que o glutamato exerce um importante papel na fisiopatologia da DP. Com a depleção dopaminérgica nigroestriatal, as projeções glutamatérgicas do núcleo subtalâmico para os gânglios da base tornam-se hiperativas, ocorrendo alterações regulatórias nos receptores de glutamato, nestas regiões. Existem, também, evidências de atividade glutamatérgica aumentada no corpo

estriado, em modelos animais, e o bloqueio de receptores glutamartérgicos atenua as manifestações motoras da DP (BLANDINI et al., 1996).

Nos pacientes com DP, a degeneração de neurônios dopaminérgicos nigrais na substantia nigra pars compacta resulta na perda da modulação dopaminérgica e aumenta a hiperatividade nos gânglios da base, rompendo o controle motor voluntário e causando os sintomas característicos da DP (JOHNSON et al., 2009, JENNER, 2008). O restabelecimento do equilíbrio entre os circuitos excitatório e inibitório nos gânglios da base, após a perda de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta, representa assim um grande desafio para o tratamento da DP. O desequilíbrio em favor da excitação na DP pode acelerar os processos excitotóxicos, representando então um alvo potencial para terapias neuroprotetoras (AMALRIC et al., 2013).

Assim, a sinalização glutamatérgica excessiva nos gânglios da base está associada com a progressão da DP e aparecimento de discinesia, após tratamento prolongado com L-DOPA. Considerável número de pesquisas foca na descoberta e desenvolvimento de compostos que modulem sinalização, via receptores glutamatérgico, para o tratamento de DP e de discinesia induzida por L-DOPA. Desta maneira, agentes terapêuticos que regulam transmissão glutamatérgica são alvos para o desenvolvimento de drogas direcionadas à melhora dos sintomas motores da DP e da discinesia associada a L-DOPA (DUTY, 2012, GASPARINI et al., 2013).

BENNOUR et al. (2013) mostraram que receptores glutamatérgicos metabotrópicos do grupo III, localizados nos terminais pré-sinápticos dos gânglios basais, tornam-se hiperativos devido à depleção dopaminérgica, na doença de Parkinson. Por esta razão, tais receptores (mGlu III) e, em particular, o mGlu4 têm sido considerados alvos específicos para o tratamento farmacológico não-dopaminérgico da DP, com foco na modulação destes terminais pré-sinápticos, sem produzir discinesia. Na verdade, estes estudos suportam o potencial clínico do uso combinado de L-DOPA e de moduladores alostéricos positivos do receptor mGlu4.

Mas, em geral, resultados dos estudos clínicos acerca da utilização de antagonistas de receptores glutamatérgicos NMDA, no tratamento da DP, têm sido desapontadores e mostram-se associados a efeitos adversos graves. Contudo, estudos recentes mostram que a seletividade de ação do antagonista no receptor NMDA é pré- requisito cardinal para a sua eficácia e, assim, esforços estão sendo despendidos para o desenvolvimento de antagonistas de subunidades específicas de receptores

glutamatérgicos NMDA (principalmente da subunidade NMDAR-NR2B), como já descrito.

Propõe-se, para a obtenção de efeitos benéficos nos estádios avançado da DP, que a estimulação glutamatérgica de receptores NMDA deva ser acompanhada por modulação alostérica, via sitio modulatório da glicina. Esta proposição baseia-se nos seguintes resultados: 1) meta-análises em pacientes esquizofrênicos, indicando que agonistas nos sítios glicinérgicos, incluindo-se a própria glicina e a D-serina, aleviam sintomas parkinsonianos induzidos por antipsicóticos; 2) observações de estudos clínicos, indicando que a hipofunção de receptores NMDA é associada a distúrbios motores; 3) resultados preliminares com D-serina, em pacientes com DP; 4) dados indicando a eficácia da glicina em modelo de discinesia tardia, em ratos; 5) ausência de dados indicativos de excitotoxicidade, após uso crônico de elevadas doses de glicina como suplemento nutricional (HERESCO-LEVY et al. 2013).

Pesquisas (GASPARINI et al., 2013) com foco na sinalização de receptores de glutamato nos gânglios da base revelam a existência de uma rede complexa de intercomunicação entre diferentes receptores glutamatérgicos, dopamina e receptores de adenosina. À medida que compreendamos melhor a importância destas interações, seremos capazes de desenvolver compostos que regulem, de maneira mais refinada, as neurotransmissões dopaminérgicas e não-dopaminérgicas, levando a novos e melhores tratamentos para a DP e discinesia associada a L-DOPA.

Tirosina hidroxilase (TH) é a enzima limitante da velocidade na biossíntese da catecolamina cérebro, e catalisa a formação de L-DOPA, o passo limitante da velocidade na biossíntese da DA. Assim, DP pode ser considerado como uma síndrome de deficiência de TH no estriado (ZHU et al, 2012;. TABREZ et al, 2012). Acredita-se que a DA, regulada pela atividade da TH, interage com a proteina alfa-sinucleina, resultando em agregados intracelulares conhecidos como corpos de Lewy, e levando, em ultima análise, à morte celular por apoptose (NAKASIMA et al, 2012). No presente trabalho, observamos que PTX aumentou a imunomarcação para TH no lado lesionado do corpo estriado com relação ao lado lesionado do grupo não-tratado. Este último grupo apresentou quase nenhuma célula positiva para TH.

Resultados semelhantes foram demonstrados nos dados de imuno- histoquímica para o transportador de dopamina no estriado (DAT). Sabe-se que os sintomas da DP são causados não somente por perdas significativas de dopamina, como também do transportador de DA (DAT), nos gânglios da base. Na DP, neurônios

dopaminérgicos viáveis expressam o transportador de dopamina (DAT) e liberam DA (MADRAS et al., 2006). Trabalhos prévios (SOSSI et al., 2007) mostram que, na DP, níveis aumentados de DAT estão diretamente associados com a diminuição no turnover e nas concentrações sinápticas da DA. Tais dados indicam que um papel funcional importante da DAT é manter as concentrações sinápticas de DA relativamente constantes e preservar este neurotransmissor nos terminais nervosos. A diminuição de DAT, embora represente potencialmente um mecanismo compensatório nos estádios iniciais da doença, pode em última análise resultar num turnover aumentado de DA e em grandes oscilações nas concentrações sinápticas de DA, predispondo a ocorrência de complicações motoras à medida que a doença progride (SOSSI et al., 2007). Mostramos que a imunomarcação para DAT foi menor no lado direito do grupo lesionado e mais intenso no grupo lesionado e tratado pela PTX, o que, de acordo com Sossi et al., 2007, pode ser uma característica promissora de uma possível droga antiparkinsoniana. Assim, os efeitos da PTX sobre esses dois biomarcadores de DP demonstram que esta droga pode ser útil para o tratamento da DP.

Dados de estudos post-mortem de doentes de Parkinson e modelos experimentais revelam perda dramática de neurônios dopaminérgicos, na substância negra, associada a uma maciça astrogliose e presença de micróglia ativada (CHOI E SUK, 2007). Estas células da glia podem liberar compostos deletérios, tais como prostaglandinas e citocinas pró-inflamatórias que, por sua vez, estimulam a produção de ROS e exercem efeito direto sobre neurônios dopaminérgicos, pela ativação de receptores envolvidos com mecanismos neuronais apoptóticos. Estudos mostram que células da glia e a micróglia em particular constituem uma fonte importante de mediadores inflamatórios e podem ter um papel fundamental nas desordens do SNC desde dor neuropática e epilepsia até doenças neurodegenerativas (SKAPER et al., 2012).

Marcadores celulares são instrumentos valiosos para o estudo da função celular em condições normais, como também em condições patológicas e em processos de reparo da célula. Assim, a descoberta de proteínas específicas para certos tipos de células levou ao desenvolvimento de anticorpos célula-específicos, utilizados para identificar células in situ. Desta maneira, astrócitos expressam a proteína acídica fibrilar glial, conhecida como GFAP. Por outro lado, anticorpos anti-OX-42 apesar de inespecíficos, pois reagem com um grande número de células, interagem também com micróglia. Os anticorpos anti-OX-42 (GRAEBER et al., 1989; KINGHAM et al., 1999)

e MAC-1 (PERRY et al., 1985) reconhecem o receptor do complemento CR3 (CD11b/CD18), expresso em microglia de rato e camundongo. Mostramos uma intensa imunomarcação para OX-42, no corpo estriado do grupo lesionado (não-tratado), que foi reduzida no grupo lesionado e tratado pela PTX. Observou-se também uma redução na imunomarcação para GFAP, no grupo lesionado, após tratamento com PTX.

Durante vários anos, células microgliais foram consideradas como tendo apenas funções nutritivas e de suporte no SNC. Entretanto, evidências nesta última década mostram, de modo contundente, que tais células têm um papel ativo nas funções sinápticas. Uma característica importante da micróglia é a sua capacidade de sintetizar e secretar grande número de substâncias, incluindo-se fatores de crescimento, citocinas, fatores do complemento, mediadores lipídicos, componentes da matriz extracelular, enzimas, radicais livres, óxido nítrico e prostaglandinas. Embora baixos níveis destes mediadores inflamatórios possam ter um papel vital na regeneração e reparo de tecidos danificados, níveis elevados de tais produtos podem contribuir para a degeneração neuronal (MINGHETTI e LEVI, 1998, MIKA et al., 2007).

Por sua vez, a ativação de astrócitos é uma característica importante, em muitas patologias do SNC. De modo semelhante ao que ocorre com a micróglia, a ativação de astrócitos é caracterizada por uma alteração na morfologia da célula, incluindo hipertrofia e aumento na produção de mediadores inflamatórios. Resultados recentes (NORSTED et al., 2013) mostraram que a PTX inibe, também, atividades de astrócitos pela inibição de vias específicas. Assim, a inibição de ativação de células da glia pela PTX é importante característica da droga, no que tange aos seus possíveis efeitos neuroprotetores.

Sabe-se que a neuroinflamação mediada por micróglia parece exercer um importante papel na patogênese da DP, evidência que se fundamentou em estudos post- mortem e experimentais. Outras evidências sugerem (SAWADA et al., 2006) que a microglia ativada pode ser neuroprotetora ou neurotóxica, à medida que a neurodegeneração de neurônios dopaminérgicos progride, na DP. As concentrações de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-alfa, IL-1B, IL-2 e IL-6, são elevadas no cérebro e líquido cérebro-espinhal de pacientes com DP (MOGI et al., 1994, NAGATSU e SAWADA, 2005, CHEN et al., 2008). Estudos mostram a presença de micróglia reativa, na substância negra de pacientes com DP, indicando que este processo inflamatório dependente de micróglia pode certamente agravar a neurodegeneração, por meio da liberação de fatores inflamatórios como citocinas, particularmente nos estádios

finais da doença (WILMS et al., 2007). Portanto, drogas com ação anti-inflamatória como a PTX revelam-se agentes promissores a serem considerados para o tratamento de doenças neurodegenerativas como a DP.

Como esperado, mostramos também que PTX diminui a imunomarcação para TNF-alfa no corpo estriado e Protege contra o aumento desta citocina, observado nos animais lesionados por 6-OHDA e não-tratados por PTX. Há mais de uma década, sabe-se que PTX é capaz de suprimir a síntese de TNF-alfa in vivo e in vitro e são vários os trabalhos que comprovaram posteriormente este efeito da droga (ZABEL et al., 1992, POLLICE et al., 2001, QING et al., 2004, ZHANG et al., 2005, GONZÁLEZ- ESPINOZA et al., 2011).

O estado inflamatório crônico subjacente, evidente na DP, sugere fortemente o papel da neuroinflamação na morte da célula dopaminérgica (WAHNER et al. 2007). Assim, estudos (SAWADA et al., 2006) relataram um aumento acentuado dos níveis de citocinas, no cérebro e no fluido cerebrospinal de pacientes com DP, e uma maior densidade de células gliais que exprime TNF-alfa, IL-1 beta e outras citocinas na SNPC dos pacientes com DP, em comparação com controles pareados por idade. Mostramos que, enquanto os animais lesionados não tratados apresentaram uma imunorreatividade elevada para o TNF-alfa, PTX diminuiu o número de células imunopositivas, não apenas no corpo estriado, mas também no hipocampo. PTX é um potente inibidor do TNF-alfa, e um estudo recente (MUCHHALA e BENZEROUAL, 2012) mostrou que ele tem o potencial para inibir as vias pró-inflamatórios e pró- apoptóticos, através da supressão de TNF-alfa e uma via dependente de caspase em células neuronais PC12, sugerindo efeitos protetores potenciais contra a neurodegeneração mediada por inflamação. Curiosamente, os dados recentes indicam que as características não-motores da DP, incluindo depressão, estão associados a níveis mais elevados de CSF marcadores inflamatórios (LINQVIST et al., 2013).

Considerando-se que a PTX, além de ser um inibidor da fosfodiesterase, aumenta os níveis de cAMP e diminui o TNF-alfa, que também apresenta propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes, tal como já foi demonstrado por nós (VIANA I., 2013) e outros (ABDEL-SALAM et al ., 2003;. BESHAV et al, 2001). A ação anti- inflamatória do PTX provavelmente está relacionada à sua capacidade de suprimir a produção de radicais de oxigênio, para eliminar as espécies reativas de oxigênio (BHAT e MADYASTHA, 2001) e ao bloqueio extracelular regulada quinase (ERK) fosforilação e produção de TNF-alfa (SANDOVAL et al ., 2009). Além disso, a

administração de rolipram, um inibidor de PDE4 como a PTX, associada a uma droga anti-depressiva aumentou os níveis de ARNm do BDNF (FUJIMAKI et al., 2000). Outros mostraram que o BDNF contribui para a ação terapêutica das drogas antidepressivas (SHIRAYMA et al., 2002).

Sabe-se que a TNF-alfa é uma citocina pró-inflamatória, envolvida em grande número de respostas celulares, incluindo-se inflamação, diferenciação celular e apoptose. Esta proteína pode ser sintetizada e liberada no cérebro, por vários tipos de células, incluídoo os astrócitos, microglia e neurônios. Evidências indicam que a TNF- alfa pode sofrer upregulation, em casos de doenças neurodegenerativas como a DP, entre outras, exercendo suas funções biológicas por meio da estimulação de dois receptores, TNF-R1 e TNF-R2. Ambos induzem ativação da via NF-kB (MARCHETTI et al., 2004, EISEL et al., 2006). Assim, a TNF-alfa surge como um importante alvo para a manipulação terapêutica, pelo seu papel na morte celular, mediada por neuroinflamação, como é ocaso da DP (TWEEDIE et al., 2007, FRANKOLA et al., 2011).

Sabe-se, portanto, que um importante efeito da PTX é a inibição da resposta inflamatória, especialmente a downregulation da TNF-alfa. PTX suprime a transcrição gênica da TNF-alfa, a expressão do mRNA para TNF-alfa e a secreção desta em macrófagos e monócitos (TAHA et al., 2009). Assim, a atenuação da morbidade e mortalidade no choque séptico tem sido atribuída à capacidade da PTX em suprimir a indução de TNF-alfa.

Por outro lado, a PTX exerce um papel neuroprotetor, em várias condições patológicas. Assim, estudos de ZHANG et al., 2005, mostraram que a PTX apresenta efeitos cardioprotetores, em casos de injúria, resultante de isquemia-reperfusão cardíaca advindas da redução na ativação de NF-kB e da produção de TNF-alfa. Outros pesquisadores mostram que a PTX melhorou as características histológicas de pacientes com esteatohepatite não-alcoólica, com relação ao grupo placebo, tendo sido bem tolerada (ZEIN et al., 2011). Outros (LI et al., 2011) também mostraram, em pacientes com doença gordurosa hepática de origem não-alcoólica, que a PTX reduz os níveis de AST e ALT e melhora as características histológicas do fígado. Contudo, nesse estudo a PTX não pareceu afetar os níveis de citocinas. Evidências recentes (GONZALEZ- ESPINOZA et al., 2012) mostraram que a PTX, em pacientes submetidos a hemodiálise, diminui de modo significante as concentrações séricas, não apenas de