Os dados foram submetidos ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e comparados por meio do teste ANOVA, seguido do pós- teste de Bonferroni [nível de significância: 5%, dados paramétricos descritos na forma: média ± erro-padrão da média (EPM)].
RESULTADOS
Análise qualitativa do ligamento periodontal
Nos dentes pertencentes ao GC, as fibras se mostravam longas e embotadas, com distribuição acentuada de colágeno tipo I no terço cervical e tipo III no terço apical. A distribuição dos diferentes tipos de colágeno se mostrou alterada nos dentes irradiados. Em relação ao GE I, o perfil de organização das fibras de colágeno mudava sua conformação. As fibras se dispunham de forma menos difusa, mas organizadas, e, no terço cervical, predominou o colágeno tipo I, ao passo que no terço apical predominou o colágeno tipo III. Em relação ao GE II, as fibras de colágeno, por vezes escassas, dispunham-se de forma difusa, desorganizadamente arranjadas e não havia um padrão de predominância do subtipo de colágeno por regiões da raiz dentária. Havia zonas de predominância ora de colágeno tipo I, ora de colágeno tipo III, independente da região. (Figura 1 e figura 2).
Não houve diferença entre os valores de percentual de área de colágeno dos ligamentos periodontais do GC (18.8±4.1%), GE I (14.7±2.7%) ou GE II (15.5±2.4%) (p=0.619).
O percentual de área representada por colágeno tipo I se mostrou significantemente reduzido nos grupos GE I (48.8±6.1%) ou GE II (49.1±5.0%) em relação ao ligamento periodontal do GC (69.7±6.3%) (p=0.047). O percentual de área representada por colágeno tipo III se mostrou significantemente maior nos grupos GE I (51.2±6.1%) ou GE II (50.9±5.0%) em relação ao ligamento periodontal do GC (24.8±5.1%) (p=0.006). (Gráfico 1).
A relação entre fibras de colágenos tipo I e III se mostrou significantemente reduzida nos grupos irradiados quando comparados ao controle. A proporção média de fibras tipo I no GE I foi de 1.1±0.2 para cada fibra de colágeno tipo III. No GE II, a proporção média de fibras tipo I foi 1.1±0.1 para cada fibra de colágeno tipo III. Por outro lado, a proporção média de fibras tipo I no GC foi na ordem de 2.5±0.3 para cada fibra de colágeno tipo III (p=0.005). (Gráfico 2).
Análise qualitativa da dentina
Em relação à dentina, observou-se, no GC, uma predominância de colágeno tipo I na região peripulpar e mais periférica, adjacente ao cemento. O colágeno tipo III predominava na região central entre essas duas regiões.
O GE I apresentou predominância de colágeno tipo III na região próxima à polpa, e de colágeno tipo I nas regiões mais periféricas em relação à polpa, com pouco ou quase nenhum colégano tipo I na região peripulpar. Além disso, observou-se que a proporção de colágeno tipo I era maior no terço apical, quando comparado ao terço médio e cervical.
O GE II apresentou predominância de colágeno tipo III, principalmente no terço apical. Além disso, nota-se, no terço apical, uma desorganização do padrão de fibras colágenas, visualizando-se uma perda da conformação dos túbulos dentinários. As regiões correspondentes a lesões cariosas também apresentaram uma predominância de colágeno tipo III perilesionalmente. (Figura 1 e figura 2).
DISCUSSÃO
As cáries de radiação são tidas como resultado da combinação de higiene oral deficiente, aumento da ingestão de alimentos ricos em açúcar e carboidratos, alterações salivares que resultam em deficiência dos mecanismos de auto-limpeza oral e diminuição da imunocompetência local associados aos efeitos destrutivos diretos dos tecidos dentais duros23. Essas cáries são, portanto, o resultado da interrelação de inúmeros fatores intrínsecos e extrínsecos do hospedeiro24.
Em relação aos dentes incluídos no campo de radiação, foi sugerido que a destruição do colágeno contido na polpa dentária contribui para fibrose secundária e diminuição da sua microvascularização e metabolismo, interferindo, portanto, sobre o metabolismo dos odontoblastos: a obliteração dos túbulos dentinários precedida pela degeneração dos processos odontoblásticos mostrou-se ser o principal resultado do dano radiogênico celular direto6,24. Estudiosos sugeriram que um déficit no metabolismo combinado com o dano latente do parênquima pulpar resultaram em cáries de subsuperfície25. Essas lesões seriam o principal fator de contribuição para o rápido e atípico progresso das cáries de radiação que não seriam justificados apenas pela hipossalivação26.
O aumento da quantidade de colágeno tipo III e a diminuição do colágeno tipo I nas regiões peripulpares da dentina dos dentes submetidos a radiação podem, em parte, ser explicados pela alteração do metabolismo e degradação dos odontoblastos associados à formação de uma dentina mais primitiva, dada a rápida progressão das lesões de cárie por radiação.
Estudos in vitro evidenciaram a presença de alterações em esmalte e dentina de dentes submetidos a radiação11,25,27. Outros estudos demonstraram que a radiação não apresenta efeitos diretos na estrutura inorgânica de dentes humanos, sendo as alterações dentárias observadas em pacientes com neoplasia maligna de cabeça e pescoço após RT devidas a alterações na matriz orgânica dos seus tecidos28,29. De fato, análises em microscopia eletrônica do esmalte revelaram alterações morfológicas estruturais mais
significativas da sua região interprismática (superfície e junção amelo- dentinária), o que corresponde à sua matriz orgânica. É provável que as alterações nessas regiões, que concentram água, resultem de radicais livres e de acúmulo de espécies reativas de oxigênio que podem reagir e danificar os componentes orgânicos. Sugere-se que, por conta das alterações estruturais sofridas, o esmalte seja menos resistente ao ataque ácido após radiação25,27. Contudo, a aplicação de radiação não promove alterações significativas da microdureza do esmalte dentário como um todo30.
O mesmo estudo de análise em microscopia eletrônica, ao avaliar a dentina de dentes permanentes após as doses de radiação acumuladas de 30 e 60 Gy, revelou degradação de colágeno e alterações micro-morfológicas generalizadas, evidenciadas pela presença de obliteração dos túbulos dentinários e fissuras na estrutura dentinária, além da fragmentação da rede de fibras de colágeno, possivelmente resultante da perda de sua hidratação, o que torna o tecido seco e friável25, achados estes que estão de acordo com os resultados do presente trabalho. Irradiação de proteínas provoca alterações em suas estruturas secundárias e terciárias, com efeitos nocivos sobre a hidratação das fibras de colágeno pela ação de radicais livres31.
A radiação ionizante apresenta efeitos diferentes sobre a microdureza do esmalte e dentina. Uma possível explicação pode ser o fato de a dentina apresentar teor de água maior do que o esmalte - 10% versus 4% em peso32. Um fato conhecido é que a radiação atua sobre a água conduzindo à formação de radicais livres e peróxido de hidrogênio. Desta forma, o tecido com maior teor de água pode ser mais vulnerável aos efeitos de radiação do que outro com menor teor. As alterações micro-morfológicas da dentina também podem explicar a diminuição progressiva da sua microdureza com o aumento da dosagem de radiação. Como a dentina promove suporte ao esmalte, uma dentina mais macia se torna menos eficiente, permitindo a ocorrência de fraturas e trincas na estrutura de esmalte30.
Um estudo que comparou a fração de fragmentos de colágeno de tecidos dentários mineralizados irradiados versus não irradiados não detectou diferenças nas concentrações de Hidroxilisilpiridinolina (HP) e Lisilpiridinolina
(LP), que são ligações trivalentes cruzadas de colágeno maduro (a primeira encontrada virtualmente em todos os tecidos maduros, e a segunda, na dentina e osso)9, implicando que a quantidade de colágeno danificado é equivalente nos dois grupos e que os danos radiogênicos de colágeno da dentina e esmalte não desempenham um papel crucial no curso do desenvolvimento das cáries de radiação. Essa constatação foi suportada pelo argumento de que a dentina e o esmalte apresentam relativa baixa concentração de colágeno24. Tal constatação diverge do que evidencia o presente trabalho. Vale salientar que a dose de radiação utilizada no referido estudo foi de 31.5 Gy, bastante abaixo da dosagem utilizada em RT para tratamento de neoplasias malignas de cabeça e pescoço, e que a medição de HP e LP representa apenas a mensuração de fragmentação dessas fibras e, portanto, sua estabilidade.
Outros autores descobriram que as propriedades mecânicas da dentina irrradiada in vitro foram afetadas apenas após doses experimentais acima de 500 Gy, sugerindo que danos radiogênicos diretos sem cofatores adicionais, como hipossalivação, não afetam significativamente os tecidos dentais duros11.
O ligamento periodontal desempenha um papel importante na dissipação da força mecânica, remodelação óssea alveolar e na manutenção do equilíbrio fisiológico do tecido periodontal33. Como componentes essenciais da matriz extracelular do ligamento periodontal, colágenos do tipo I e III estão intimamente correlacionados com os danos, reparação e regeneração do tecido periodontal, exercendo importante função no metabolismo dessa matriz34. Todo colágeno tipo I pode integrar-se com receptores de integrina α1 e β2 na membrana dos osteoblastos e facilitar a diferenciação osteoblástica35,36.
Diminuição da vascularidade e acelularidade do ligamento periodontal com ruptura, diminuição da sua espessura, desorientação das suas fibras e alargamento do espaço periodontal após radiação são achados que já foram relatados37 e são comuns a alguns dos achados do presente trabalho. Alterações no cemento (acelularidade e capacidade de regeneração diminuída) e no ligamento periodontal podem predispor a infecção. Tal predisposição à infecção periodontal também é potencializada pela hipossalivação radioinduzida, aumento do acúmulo de placa e alteração da microbiota oral. A
relativa baixa prevalência de periodontite crônica avançada está relacionada ao aparecimento das cáries dentais. Uma vez que a cárie de radiação se desenvolve, sua progressão é tão rápida que o dente afetado é perdido antes que a doença periodontal possa ocorrer7. Todos os dentes extraídos dos pacientes submetidos a RT, no presente trabalho, tiveram como indicação cáries de radiação.
Alguns estudos apontam que os efeitos diretos e indiretos da RT sobre o periodonto resultam em risco aumentado de perda de inserção periodontal, perda dentária e, por consequência, risco aumentado de desenvolvimento de ORN. Portanto, os pacientes portadores de neoplasias malignas de cabeça e pescoço candidatos a RT devem passar por um plano de tratamento periodontal prévio38,39. Esse potencial de perda de inserção pode explicar, em parte, a diminuição da predominância do colágeno tipo I na porção cervical (região onde se iniciam as alterações periodontais) dos dentes submetidos a mais de 60 Gy de radiação, encontrada neste trabalho.
Um estudo realizado para avaliar as alterações da atividade biológica do cemento após radiação ɣ verificou que as substâncias (dentre elas o TGF-β, que apresenta acentuada importância à produção e maturação de colágeno) que aumentam a secreção de osteoprogerina e fator inibidor de osteoclastogênese dos fibroblastos presentes no cemento irradiado são destruídas pela exposição à radiação. Consequentemente, a proliferação de osteoblastos no cemento não pode ser controlada, havendo uma tendência a anquilose40. Tal fato pode justificar, em parte, a maior predominância de colágeno tipo I nas regiões da dentina mais próximas ao cemento nos dentes não irradiados e nos dentes irradiados submetidos a menos de 60 Gy bem como a maior predominância de colágeno tipo III em todas as regiões da dentina dos dentes submetidos a 60 ou mais Gy de radiação deste presente trabalho.
Conclui-se que a radiação ionizante promove alterações do perfil de colágeno da dentina e do ligamento periodontal de dentes submetidos a RT de cabeça e pescoço, o que foi evidenciado pela significância estatística percebida em da diminuição colágeno tipo I e elevação do colágeno tipo III dos dentes que foram submetidos a radiação em comparação a dentes hígidos não irradiados. Tais alterações podem exercer um papel de destaque na instalação e desenvolvimento de cáries ou eventual doença periodontal dos dentes dos pacientes que são submetidos a RT para tratamento de neoplasias malignas de cabeça e pescoço. Contudo, é coerente destacar a necessidade de mais estudos para elucidar a real participação da alteração do padrão de colágeno dos tecidos dentais irradiados sobre a etiopatologia e desenvolvimento das cáries de radiação e doença periodontal.
COLABORADORES
Drª. Ana Paula Negreiros Nunes Alves, Paulo Goberlânio Barros Silva, Alceu Machado de Sousa e Elisa Lima Verde participaram no suporte técnico nas fases laboratoriais da pesquisa.
AGRADECIMENTOS
Ao Pró-Ensino na Saúde, por meio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de mestrado.
REFERÊNCIAS
1. Baker A, McMahon J, Parmar S. Part I: Immediate reconstruction of continuity defects of the mandible after tumor surgery. Journal of oral and maxillofacial surgery. 2001;59(11):1333-1339.
2. Hong SX, Cha IH, Lee EW, Kim J. Mandibular invasion of lower gingival carcinoma in the molar region: its clinical implications on the surgical management. International journal of oral and maxillofacial surgery. 2001;30(2):130-138.
3. Schimmele SR. Part II: Delayed reconstruction of continuity defects of the mandible after tumor surgery. Journal of oral and maxillofacial surgery. 2001;59(11):1340-1344.
4. Warnke PH, Springer ING, Wiltfang J, et al. Growth and transplantation of a custom vascularised bone graft in a man. The Lancet. 2004;364(9436):766-770. 5. Barcellos-Hoff MH, Ravani SA. Irradiated mammary gland stroma promotes the expression of tumorigenic potential by unirradiated epithelial cells. Cancer research. 2000;60(5):1254-1260.
6. Squier CA. Oral complications of cancer therapies. Mucosal alterations. NCI monographs: a publication of the National Cancer Institute. 1990;(9):169-172. 7. Vissink A, Jansma J, Spijkervet FKL, et al. Oral sequelae of head and neck radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 2003;14(3):199-212. 8. Bartel-Friedrich S, Friedrich RE, Lautenschläger C, Holzhausen HJ. Dose- response relationships and the effect of age and latency period on the expression profile of laminin in irradiated rat mandibular glands. Anticancer research. 1999;20(6D):5221-5228.
9. Acil Y, Springer I, Prasse J, Hedderich J, Jepsen S. Concentration of collagen cross-links in human dentin bears no relation to the individual age. International journal of legal medicine. 2002;116(6):340-343.
10. Schroeder HE. Oral Structure Biology: Embryology, Structure, and Function of Normal Hard and Soft Tissues of the Oral Cavity and Temporomandibular Joints. 1991;G. Thieme Verlag.
11. al-Nawas B, Grötz KA, Rose E, Duschner H, Kann P, Wagner W. Using ultrasound transmission velocity to analyse the mechanical properties of teeth after in vitro, in situ, and in vivo irradiation. Clinical oral investigations. 2000;4(3):168-172.
12. Lossdörfer S, Kraus D, Jäger A. Aging affects the phenotypic characteristics of human periodontal ligament cells and the cellular response to hormonal stimulation in vitro. Journal of periodontal research. 2010;45(6):764-771.
13. Marchesan JT, Scanlon CS, Soehren S, Matsuo M, Kapila Y L. Implications of cultured periodontal ligament cells for the clinical and experimental setting: a review. Archives of oral biology. 2011;56(10):933-943.
14. Murakami Y, Kojima T, Nagasawa T, Kobayashi H, Ishikawa I. Novel isolation of alkaline phosphatase-positive subpopulation from periodontal ligament fibroblasts. Journal of periodontology. 2003;74(6):780-786.
15. Lekic PC, Pender N, McCulloch CAG. Is fibroblast heterogeneity relevant to the health, diseases, and treatments of periodontal tissues?. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 1997;8(3):253-268.
16. Tzaphlidou M. Collagen as a model for the study of radiation induced side effects: use of image processing. Micron. 2002;33(2):117-120.
17. Ryan ME, Golub LM. Modulation of matrix metalloproteinase activities in periodontitis as a treatment strategy. Periodontology. 2000;24:226-238.
18. Redlich M, Reichenberg E, Harari D, Zaks B, Shoshan S, Palmon A. The effect of mechanical force on mRNA levels of collagenase., collagen type I, and tissue inhibitors of metalloproteinases in gingivae of dogs. J Dent Res. 2001;80(12):2080-2084.
19. Nohutcu RM, McCauley LK, Koh AJ, Somerman MJ. Expression of extracelular matrix proteins in human periodontal ligament cells during mineralization in vitro. J Periodontol. 1997;68(4):320-327.
20. Chen X, Li N,Liu J, Chen J,Liu H. Expression of collagen I, collagen III and MMP-1 on the tension side of distracted tooth using periodontal ligament distraction osteogenesis in beagle dogs. Archives of oral biology. 2014;59(11):1217-1225.
21. Konstantonis D, Papadopoulou A, Makou M, Eliades T, Basdra EK, Kletsas D. Senescent human periodontal ligament fibroblasts after replicative exhaustion or ionizing radiation have a decreased capacity towards osteoblastic differentiation. Biogerontology. 2013;14(6):741-751.
22. Andrade TA, Iyer A, Das PK et al. The inflammatory stimulus of a natural latex biomembrane improves healing in mice. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research. 2011;44(10):1036‐1047.
23. Lieshout HFJ, Bots CP. The effect of radiotherapy on dental hard tissue - a systematic review. Clinical oral investigations. 2014;18(1):17-24.
24. Springer IN, Niehoff P, Warnke PH, et al. Radiation caries - radiogenic destruction of dental collagen. Oral oncology. 2005;41(7):723-728.
25. Grötz, KA, Duschner H, Kutzner J, et al. New evidence for the etiology of so-called radiation caries. Proof for directed radiogenic damage of the enamel- dentin junction. Strah-lenther Onkol. 1997;173(12):668-676.
26. De Moor R. Direct and indirect effects of medication (including chemotherapy) and irradiation on the pulp. Rev Belge Med Dent. 2000;55(4):321-323.
27. Grötz KA, Duschner H, Kutzner J. Histotomography studies of direct radiogenic dental enamel changes. .Mund Kiefer Gesichtschir. 1998; 2(2):85- 90.
28. Jansma J, Buskes JA, Vissink A, et al. The effect of X-ray irradiation on the demineralization of bovine dental enamel. Caries research. 1988;22(4):199-203. 29. Zach GA. X-ray diffraction and calcium-phosphorous analysis of irradiated human teeth. Journal of dental research. 1976;55(5):907-909.
30. Gonçalves LMN, Palma-Dibb RG, Paula-Silva FWG. Radiation therapy alters microhardness and microstructure of enamel and dentin of permanent human teeth. Journal of dentistry. 2014;42(8):986-992.
31. Chistiakov DA, Voronova VN, Chistiakov PA. Genetic variations in DNA repair genes, radiosensivity to câncer and susceptibility to acute tissue reactions in radiotherapy-treated câncer patients. Acta oncológica. 2008;47:809-824.
32. Mjör IA. Dentin permeability: the basis for understanding pulp reactions and adhesive technology. Brazilian dental journal. 2009;20(1):3-16.
33. Ku SJ, Chang YI, Chae CH, et al. Static tensional forces increase osteogenic gene expression in three-dimensional periodontal ligament cell culture. BMB Rep. 2009;42(7):427-432.
34. Sculean A, Junker R, Donos N, Windisch P, Brecx M, Dunker N. Immunohistochemical evaluation of matrix molecules associated with wound healing following treatment with an enamel matrix protein derivative in humans. Clin Oral Investig. 2003;7(3):167-174.
35. Sandberg MM, Aro HT, Vuorio EI. Gene expression. During bone repair. Clin Orthop Relat Res. 1993;289:292-312.
36. Maehata Y, Takamizawa S, Ozawa S, et al. Both direct and collagen- mediated signals are required for active vitamin D3-elicited differentiation of human osteoblastic cells: roles of osterix, na osteoblast-related transcription factor. Matrix Biol. 2006;25(1):47-58.
37. Anneroth G, Holm LE, Karlsson G. The effect of radiation on teeth. A clinical, histological and microradiographic study. Int J Oral Surg. 1985;14(3):269-274.
38. Epstein JB, Stevenson-Moore P. Periodontal disease and periodontal management in patients with cancer. Oral oncology. 2001;37(8):613-619.
39. Schiødt M, Hermund N. Management of oral disease prior to radiation therapy. Supportive care in cancer. 2002;10(1):40-43.
40. Nishimura K, Tsuciya H, Takada K, et al. Effects of irradiation on cementum matrix cytokins function during periodontal regeneration. Human cell. 2003;16(4):217-229.
GRÁFICOS
Gráfico 1: Quantificação do colágeno no ligamento periodontal de dentes de pacientes submetidos a diferentes doses de radioterapia de cabeça e pescoço. (*p<0.05 versus grupo controle; média ± erro-padrão).
Gráfico 2: Avaliação da relação de fibras de colágeno tipo I:III no ligamento periodontal de dentes de pacientes submetidos a diferentes doses de radioterapia de cabeça e pescoço. (*p<0.05 versus grupo controle; média ± erro-padrão).
FIGURAS
Figura 1: Fotomicrografias de dentes irradiados (≥ 60 Gy e < 60 Gy), mostrando alteração no perfil de colágenos tipo I e tipo III em dentina e em ligamento periodontal. (Picrosirius Red sob luz polarizada, 200X)
Figura 2: Fotomicrografias de dentes irradiados cariados (< 60 Gy e ≥ 60 Gy), mostrando alteração no perfil de colágenos tipo I e tipo III em dentina perilesional. (Picrosirius Red sob luz polarizada, 200X)
Figura 3: Fotomicrografias de dentes hígidos não irradiados, mostrando o perfil de colágenos tipo I e tipo III em dentina e ligamento periodontal. (Picrosirius Red sob luz polarizada, 200X)