Com a finalidade de compreender de que forma a emissão de Compostos Orgânicos Voláteis (COVs) seria alterada em P. pinaster Ainton, quando infetado por NMP procurou-se detetar, identificar e quantificar COVs emitido por P. pinaster são e P. pinaster infetado com NMP. Para garantir que possíveis alterações no perfil volátil fossem causadas apenas pela infeção por NMP e não pelo processo de infeção considerou-se um grupo controlo constituído por pinheiros feridos.
Uma vez que muitos dos protocolos utilizados foram otimizados e/ou utilizados pela primeira vez torna-se necessário dar ênfase aos cuidados a ter durante a manipulação e recolha de amostras. Ao longo do trabalho foram tomados vários cuidados de modo a evitar a influência de fatores externos no perfil dos compostos libertados (Holopainem & Gershenzon, 2010), nomeadamente a resposta fotoquímica das árvores após a inoculação ao longo do tempo. Para tal todas as recolhas foram criteriosamente contabilizadas em função do tempo após inoculação.
Estudos prévios em P. pinaster revelaram que, quando sujeitas a fatores de stresse as plantas apresentam uma diferente produção de COV’s (Santos & Vasconcelos, 2011), razão pela qual foi necessário recolher estes compostos ao longo do tempo para avaliar as variações apresentadas.
A extração dos COVs realizou-se recorrendo à técnica de micro-extração em fase solida (SPME). Mais uma vez vários foram os cuidados a ter quando da exposição das fibras, nomeadamente o tempo de exposição da fibra, de modo a garantir o equilíbrio químico total entre os compostos presentes na atmosfera do saco e a fibra. Para além disso houve um cuidado especial na orientação, altura e distância das várias fibras aos troncos das árvores, para manter as mesmas condições.
Durante este trabalho, o qual consideramos exploratório, foram identificados 25 compostos voláteis produzidos em condições controladas, dos quais maioritariamente hidrocarbonetos monoterpénicos. Tal resultado era esperado uma vez que os terpenos representam uma das maiores e mais diversas classes de metabolitos secundários, com aproximadamente 55000 membros isolados até hoje (Maimone & Baran, 2007).
De entre a família dos terpenos, os compostos dominantes foram, o α-pineno (36 - 56 %), o β- pineno (23 - 43 %), o limoneno (1 - 9 %) e o canfeno (vestigial - 9 %) (Tabela 1.3.1). A sua dominância prevaleceu pelos diferentes tratamentos, deduzindo-se não existir variações na composição volátil dos pinheiros sãos, feridos e inoculados. Os resultados vão de acordo com os resultados e conclusões obtidas por Lima et al. (2010), num estudo com óleos essenciais extraídos de P. pinaster são e infetado por NMP. Esperar-se-ia uma resposta diferenciadas entre
P. pinaster são, ferido e ferido e inoculado com NMP pois sabe-se que em muitas plantas,
nomeadamente algodão e tabaco, a concentrações de compostos voláteis emitidos é diferenciada, sendo mais elevadas em resposta ao ataque de fitófagos, em comparação com a emissão registada após simples dano mecânico (Reddy & Guerrero, 2004).
Partindo do pressuposto que, quando expostas, as fibras adsorveram a totalidade dos compostos presentes na atmosfera do saco de plástico, nas suas respetivas concentrações e que
22 no GC/FID a dessorção dos compostos da fibra foi total, é possível inferir a existência de uma tendência para que as quantidades relativas dos compostos emitidos em pinheiros feridos e inoculados sejam acrescidas entre o momento da inoculação/ferimento até as três horas pós inoculação (Figura 1.3.1 e Figura 1.3.2). Sendo os compostos identificados maioritariamente monoterpenos e sesquiterpenos, estas conclusões vão de acordo com a bibliografia. Um estudo realizado em gimnospérmicas como Abies grandis Lindl., evidênciou um aumento da síntese de monoterpenos e sesquiterpenos após a planta ser atacada por insetos fitófagos (Steele et al., 1998). Nestes estudo verifica-se também a formação de d-cadineno e (E)-a-bisaboleno, mesmo trantando-se do mesmo género que o nosso objeto de estudo, estes últimos compostos não foram detetados. Ainda segundo Opitz et al. (2008) em planta de algodão, após um ataque por herbívoria, evidenciou um aumento nos níveis de monoterpenos e sesquiterpenos. Assim, estes resultados reforçam a ideia de que estes compostos têm um papel ativo na defesa contra herbívoros.
Comparando os resultados obtidos aos de Lima et al. (2010), podemos deduzir que independentemente da técnica implementada, os resultados são similares e as conclusões idênticas. Esta informação poderá ser preponderante na eventual planificação de possíveis estudos futuros.
Os resultados demonstraram ainda um padrão similar dos compostos mais abundantes emitidos por pinheiro infetado e por pinheiro ferido (Figura 1.3.2).
As quantidades relativas de cada composto varia pelos dois tratamentos (inoculado e ferido), no entanto, não é possível retirarem-se conclusões a respeito das quantidades absolutas, sendo estes valores percentuais obtidos por normalização implica que esta quantificação seja fortemente influenciada por vários fatores, entre eles o volume de gases queimado pela chama do GC/FID. Uma quantificação absoluta poderia ser mais reveladora, assim como o estudo de enantiómero pela sua extrema relevância ecológica (Sjodin et al., 2000). Ainda na mesma figura, o δ-3-careno é evidenciado com uma percentagem relativa muito reduzida (0 - 8 %), sendo também associado a valores de desvio padrão consideráveis. Este fato deve-se à existência de quimiotipos diferentes
desta espécie, em que um tipo genético expressa grandes quantidades de δ-3-careno e o outro
tipo expressa quantidades vestigiais (Lima et al., 2010). Ao longo do estudo concluiu-se que
apenas uma das árvores possuía o quimiotipo que emite grandes quantidades de δ-3-careno
(réplica de pinheiro ferido), tendo acabado por influenciar o desvio padrão assim com as percentagens de todos os COVs emitidos pela mesma árvore.
Comparando os resultados obtidos com o número de nematodes da madeira do pinheiro presente no xilema feita posteriormente (Figura 1.3.3), parece não haver uma relação direta entre a infeção pelo NMP e a produção de COVs por P. pinaster (Figura 1.3.1). Esta observação pode estar relacionada com o fato das plantas se encontrarem em condições controladas, o que pode levar a uma produção de metabolitos secundários muito diferente do que poderá ser produzido em diferentes condições ambientais (Koricheva, 2002).
23 Sendo o presente trabalho, um trabalho essencialmente exploratório, podemos considerar este trabalho como um ponto de partida para futuros estudos que contemplem também a possibilidade de explorar as reacções de plantas adultas em condições naturais.
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