Kritisk  diskursanalyse  som  teori

A estimativa da abundância dos transcritos, ou seja, a contagem dos reads alinhados de volta contra a referência de trancritos montada pelo Trinity, foi realizada pelo programa eXpress (ROBERTS; PACHTER, 2012). As contagens dos reads foram sumarizadas ao nível de gene, tal como definido pelo Trinity.

Para a análise da expressão diferencial foi utilizado o pacote edgeR do programa R (versão 3.2.1), utilizando como entrada o arquivo de contagem dos

reads apenas dos contigs que foram anotados no Blast2GO como pertencentes a

fungos patogênicos, principalmente ferrugens (Puccinia e Melampsora). As contagens, ao nível de gene, por amostra foram normalizadas utilizando o método TMM (Trimmed Mean of M-values method) (ROBINSON; OSHLACK, 2010), conforme implementado no edgeR, a fim de levar em consideração a variação da população de RNA entre as amostras. Apenas os transcritos que alcançaram uma contagem por milhão em pelo menos três amostras, foram considerados como expressos e retidos para os próximos passos das análises no edgeR. Foram

considerados diferencialmente expressos os transcritos com FDR (False Discovery

Ratio) menor que 0.05 e Log2FoldChange ≥ 2 ou ≤ -2 (tratamento/controle). A

estratégia utilizada no presente trabalho para o estudo da expressão gênica foi uma análise ao logo do processo de diferenciação estrutural in vitro do patógeno. Para tanto, duas comparações foram realizadas: (i) uredóporos germinados (12 h.a.i _– “tratamento”) versus uredóporos não germinados (0 h.a.i – “controle”), chamada de comparação 12h-0h. E, (ii) estruturas de infecção formadas (24 h.a.i _{– “tratamento”)}

versus uredóporos germinados (12 h.a.i – “controle”), chamada de comparação 24h-

12h. Os scripts do R utilizados para a análise de expressão diferencial estão detalhados no ANEXO A.

3.3 Resultados

3.3.1 Germinação e diferenciação in vitro do patógeno P. psidii

A germinação dos uredóporos de P. psidii (MF-1) foi obtida em meio ágar- água (8 g/L), porém com baixa porcentagem de uredósporos germinados. Partindo das informações, que o óleo mineral induz a germinação de P. psidii (FURTADO et al., 2003) e que no genoma do isolado MF-1 de P. psidii foram encontrados muitos genes relacionados ao metabolismo de lipídeos (QUECINE et al., 2012), também foram testados meios ágar-água incrementados com 0.5% de diferentes óleos: óleo mineral, azeite de oliva, óleo de soja, óleo de canola, óleo de milho e óleo de linhaça.

Nos tempos analisados, foi possível observar a germinação dos uredósporos e crescimento de seus tubos germinativos nos meios: ágar-água, ágar-água acrescido de 0.5 % de óleo mineral e ágar-água acrescido de 0.5% de azeite de oliva. Dentre estes três meios, a germinação dos uredósporos no meio ágar-água acrescido de azeite de oliva foi muito superior quando comparada aos outros dois meios testados (Figura 3.3).

Figura 3.3 - Germinação dos uredósporos de P. psidii nos meios: ágar-água após 24 h (A) e 48 h (B) de incubação; ágar-água acrescido de 0.5% de óleo mineral após 24 h (C) e 48 h (D) de incubação; ágar-água acrescido de 0.5% de azeite de oliva após 24 h (E) e 48 h (F) de incubação. As setas pretas indicam tubos germinativos

Após 48 horas de incubação, no meio ágar-água, acrescido de azeite de oliva a taxa de germinação de P. psidii foi de aproximadamente 54,8% enquanto que no meio acrescido com óleo mineral essa taxa foi de aproximadamente 14,5%. Sendo assim, o meio contendo azeite de oliva elevou a taxa de germinação in vitro dos uredóporos de P. psidii em aproximadamente 40% quando comparado com o meio contendo óleo mineral.

Na tentativa de obter in vitro as estruturas iniciais de infecção do patógeno P.

psidii e, também, possibilitar uma melhor recuperação desse material para as etapas

de extração do RNA total, esses uredósporos foram germinados sobre membranas. Sobre o papel celofane não ocorreu a germinação dos uredósporos nos meios ágar-água, ágar-água acrescido de 0.5% de óleo mineral e ágar-água acrescido de

0.5% de azeite de oliva em nenhum dos tempos analisados (24 e 48 horas de incubação). Já, sobre as membranas de diálise, foi obtida a germinação e diferenciação estrutural (formação de apressório e hifa de penetração) de P. psidii, após 24 e 48 horas de incubação, apenas no meio ágar-água acrescido de 0.5 % de azeite de oliva (Figura 3.4). No entanto, no tempo 48 h.a.i., foi possível observar sinais de rompimento e extravasamento do citoplasma de algumas células indicando o processo de morte celular.

Figura 3.4 - Uredósporos observados em microscopia de luz 0 horas (A) e após 24 horas (B) de incubação em membrana de diálise, sobre meio agár-água acrescido de azeite de oliva (0.5%). Em (A) é possível observar os uredósporos não germinados e em (B) é possível observar a formação das estruturas iniciais de infecção a partir de um uredósporo. Onde: US: uredósporos, TG: tubo germinativo, AP: apressório e HP: hifa de penetração. Destacando o citoplasma do uredósporo, em amarelo, sendo transferido do AP para HP, e a presença de septos em HP que permite a observação de um padrão de listras amarelas, conforme ocorre a passagem do citoplasma ao longo dos septos

A análise dos resultados dos tempos 24 e 48 horas de incubação, comprovaram que a utilização do meio ágar-água acrescido de azeite de oliva (0.5%) foi significativamente melhor para a germinação dos uredósporos do que o uso de ágar-água ou ágar-água acrescido de óleo mineral (Tabela 3.1). Para todos os parâmetros avaliados, o uso da membrana de diálise junto ao ágar-água acrescido de azeite de oliva foi significativamente maior do que a ausência da membrana (Tabela 3.1).

Tabela 3.1 - Processo de diferencição de uredósporos de P. psdii

Tratamentos 1 _{Taxa de germinação}

dos uredósporos (%)2 _{relação ao número de} % de apressórios em

uredósporos germinados 3

% apressórios em relação ao número total de

uredósporos 4

24 horas 48 horas 24 horas 48 horas 24 horas 48 horas

Ágar-água 0 c 2.5 c 0 b 0 b 0 b 0 b Ágar-água Membrana 0 c 0 c 0 b 0 b 0 b 0 b Mineral 2.0 c 14.5 c 0 b 0 b 0 b 0 b Mineral Membrana 0 c 0 c 0 b 0 b 0 b 0 b Oliva 62.8 b 54.8 b 0 b 0 b 0 b 0 b Oliva Membrana 87.1 a 80.2 a 86.9 a 90 a 76.9 a 73.4 a

1 _{Todos os parâmetros foram avaliados após 24 e 48 horas de incubação dos uredósporos, por}

contagem em microscopia de luz. Foram utilizadas diferentes condições de cultivo: ágar-água (8g/L), Ágar-água (8g/L) + membrana de diálise, ágar-água (8g/L) acrescido de 0.5% de óleo mineral, ágar- água (8g/L) acrescido de 0.5% de óleo mineral + membrana de diálise, ágar-água (8g/L) acrescido de 0.5% de azeite de oliva e ágar-água (8g/L) de 0.5% de azeite de oliva + membrana de diálise.

2 _{Uredósporos que apresentaram tubo germinativo passível de serem observados em microscopia de}

luz mensurados nos diferentes tratamentos.

3 _{Apressórios formados mensurados em microscopia de luz nos diferentes tratamentos e analisados}

em relação ao número de uredósporos germinados (2)

4 _{Apressórios formados mensurados em microscopia de luz nos diferentes tratamentos e analisados}

em relação ao número total de uredósporos observados

*Para todos os dados apresentados, foram avaliadas cinco repetições biológicas (5 placas de Petri) totalizando aproximadamente 750 uredósporos contados por tratamento, sendo que os dados com a mesma letra e na mesma coluna não diferem estatisticamente (P>0,05) de acordo com o teste de Tukey.