dimensões semelhantes àquelas de antes do experimento. Dois dias depois, não foi observado traços desses mesmos analitos no meio de cultura, sugerindo que os mesmos estariam permeando a célula em processo de morte, ou que poderiam ser metabolizados por enzimas que estivessem em contato com estes analitos mesmo no meio extracelular. Os respectivos sinais analíticos voltariam a aumentar na última amostra, coletada após o período de 6 dias. Como ocorria a troca de meio a cada 48 h de incubação, com a reposição do extrato, esse aumento do sinal pode estar associado ao fato de as células estarem mortas, com as enzimas já estariam inativadas.
A banda cromatográfica em tr=10,38 min que apareceu somente após o
início do ensaio apresentou as mesmas dimensões para as amostras coletadas durante o período de incubação. Se esse sinal estivesse associado ao metabolismo das células, esperava-se uma alteração de intensidade semelhante àquela observada na amostra coletada no quarto dia de incubação. A elevada similaridade então levou a duas hipóteses: (i) havia células vivas que estariam metabolizando os compostos bioativos; ou (ii) o sinal analítico observado não corresponderia a um metabólito, mas a uma substância presente na célula (ou mesmo um fragmento) que foi liberado durante o processo de morte. Para tentar verificar essas hipóteses, tentou-se analisar os espectros de UV para o analito nas diferentes amostras e o perfil de absorbância foi semelhante àquele observado para os flavonoides derivados do campferol, sugerindo assim tratar-se mesmo de um metabólito. A análise por LC-MS não foi conclusiva, por limitações técnicas do equipamento no modo de varredura completa, principalmente para amostras em baixas concentrações. Nos ensaios de seletividade e estrogenicidade, o extrato foi diluído em meio de cultura para a concentração de 250 g.mL-1
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FIGURA 4.64 - Análise do meio extracelular dos ensaios e estrogenicidade (A) e seletividade (B) realizados com o extrato preparado com 75% de etanol. As setas vermelhas indicam as bandas cromatográficas possivelmente associadas ao metabolismo dos
compostos bioativos
A última análise de meio extracelular foi realizada para os sistemas incubados com o extrato preparado com 85% de etanol. Esse extrato induziu a morte celular tanto no teste de estrogenicidade quanto no teste de seletividade. Nas análises dos meios extracelulares do primeiro teste, notou-se uma elevada similaridade na intensidade dos sinais analíticos para 6, 7, 9 e 10 até a amostra coletada no quarto dia de incubação, sugerindo que os analitos não estariam permeando a membrana celular (FIGURA 4.65A). Uma redução significativa na intensidade desses sinais aconteceu no último dia de incubação, sugerindo que esses compostos conseguiram de alguma forma permear para o interior da célula.
Para os analitos 2, 11 e 12, observou-se a redução na intensidade do sinal logo nos dois primeiros dias de incubação, o qual permaneceu baixo e estável nos dias subsequentes, sugerindo que os analitos estavam passando para o interior da célula mesmo com o processo de morte celular iniciado. O aparecimento das bandas cromatográficas com tr= 10,40; 11,30 e 12,20 min, possivelmente
associadas a metabólitos, nas amostras coletadas durante o período de incubação sugeriu que no meio das células em processo de morte celular também haveria células que continuariam metabolizando os compostos bioativos. O aumento contínuo no sinal analítico em tr=10,40 min em detrimento da redução da intensidade
das bandas cromatográfica dos flavonoides seria uma forte evidência da atividade metabólica por células viáveis.
Na análise dos meios de cultura do teste de seletividade, não foi possível observar alterações significativas nas intensidades dos sinais analíticos
12 6 7 9 10 11 12 6 7 9 10 11 2 2
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para os flavonoides 9 a 12, sugerindo que esses compostos não estariam sendo metabolizados pelas células em processo de morte (FIGURA 4.65B). Para os flavonoides derivados da quercetina (6 e 7), notou-se uma redução gradativa na intensidade das bandas cromatográficas à medida que o tempo de incubação aumentava, sugerindo que esses compostos estariam permeando a célula e seriam metabolizados. Além disso, a banda cromatográfica em tr=10,40 min apresentou
uma elevada similaridade nas 3 amostras coletadas durante o período de incubação, sugerindo a existência de células que estariam metabolizando regularmente os compostos bioativos.
FIGURA 4.65 - Análise do meio extracelular dos ensaios e estrogenicidade (A) e seletividade (B) realizados com o extrato preparado com 85% de etanol. As setas vermelhas indicam as bandas cromatográficas possivelmente associadas ao metabolismo dos
compostos bioativos
Tanto o extrato preparado com 45 % de etanol (v/v) quanto aquele preparado com 75% (v/v) apresentaram o mesmo tipo de atividade estrogênica, com agonismo parcial. Dessa forma, esperava-se em princípio que as análises dos meios extracelulares apresentassem perfis semelhantes. No entanto, o que se pode perceber foram algumas diferenças nos perfis para os sistemas que foram incubados cada tipo de extrato. Essas análises sugeriram então que o efeito biológico observado, a estimulação do crescimento celular, poderia não estar diretamente relacionado com os flavonoides de forma independente, mas com interações entre mais de um composto bioativo presente.
Uma possibilidade que está em aberto se refere a avaliação do tipo de estresse metabólico que ocorre nas células que leva a uma diferença de consumo dos compostos para estes extratos. Outra característica importante a ser avaliada se refere a possibilidade de reação destas substâncias no próprio meio extracelular, seja por enzimas excretadas ou por compostos reativos derivados do processo de
12 6 7 9 10 11 12 6 7 9 10 11 2 2
184 morte celular.