Dos animais procedentes de Bauru, 45 (45%) revelaram formas amastigotas em graus variados de parasitismo, porém todos eles apresentaram pelo menos uma forma amastigota bem definida, com citoplasma, cinetoplasto e núcleo, dentro de macrófagos (Figura 6) ou solta (Figura 7).
Muitos dos animais nos quais não se identificaram formas amastigotas em pelo menos uma das três lâminas examinadas, apresentaram resultados positivos em outras provas. Dos 55 cães negativos nesse exame, 38 (69,1%) foram positivos na RIFI, 38 (69,1%) no ELISA e 36 (65,4%) na PCR (Tabela 6), resultando em baixa sensibilidade quando comparada às outras provas, entretanto, apresenta elevada especificidade, sendo considerada segura para a leishmaniose quando resulta positiva (MOREIRA et al., 2002). O exame parasitológico direto foi considerado como padrão-ouro para o cálculo da sensibilidade das demais provas utilizadas neste estudo.
TABELA 6 Resultados das provas RIFI, ELISA e PCR LIN R4 e LIN 19 nos 55
cães negativos de Bauru no exame parasitológico direto. Botucatu 2008.
EXAME POSITIVOS PORCENTAGEM
RIFI 38 69,1% ELISA 38 69,1%
PCR LIN R4 e LIN 19 36 65,4%
O baixo parasitismo em linfonodos foi sugerido no estudo que comparou a sensibilidade do cultivo desses órgãos com o de baço em 64 cães soropositivos para LV de área endêmica no Brasil. A sensibilidade da cultura de baço foi 97,9%, e a de linfonodo 25%. Esses resultados sugerem o uso do baço em vez do aspirado de linfonodo para o diagnóstico parasitológico da infecção (BARROUIN-MELO et al., 2004).
FIGURA 6 Foto tirada em microscopia óptica de uma lâmina de aspirado de
linfonodo corada ao Giemsa, de um cão de Bauru, apresentando formas amastigotas fagocitadas dentro de um macrófago (ninho de amastigotas). Aumento 100X.
FIGURA 7 Foto tirada em microscopia óptica de uma lâmina de aspirado de
linfonodo corada ao Giemsa, de um cão de Bauru, apresentando formas amastigotas com as estruturas bem visíveis: núcleo e cinetoplasto, corados em roxo e o citoplasma corado em rosa. Nesta foto, elas aparecem fora das células. Aumento 100X.
Os métodos de detecção direta, que incluem esfregaços, imprintings, cortes histológicos e isolamento em meios de cultura, não conseguem confirmar a doença de maneira satisfatória. A sensibilidade normalmente é reduzida pelo fato de que a detecção do parasito depende da carga parasitária no aspirado ou amostra tecidual (ASHFORD et al, 1995).
Em contrapartida encontra-se na literatura resultados diferentes. Foram realizados cultivos de baço, fígado, aspirado de medula óssea e linfonodo e PCR de 143 cães com as mesmas amostras, e não se encontrou diferença estatística entre os cultivos de baço (22% de positividade), linfonodo (19,3%) e medula óssea (17,5%), enquanto que o fígado apresentou somente 15% de positividade. Esse resultado confirma que nas infecções caninas, o baço e linfonodos são os principais tecidos para a invasão e multiplicação de leishmanias. As diferenças relacionadas à infecção entre os vários tecidos do mesmo animal, podem ser explicadas pelo potencial de distribuição do parasito em cada órgão, associado à resposta imune. Pode-se concluir que o linfonodo é um bom órgão para realização da pesquisa de parasitos a partir de cultura ou PCR (MAIA et al., in press).
Moreira et al (2002) pesquisou em Araçatuba, região endêmica para a enfermidade, 60 exames citopatológicos de casos suspeitos de LVC utilizando aspirado de linfonodo por agulha fina. Os esfregaços foram corados pelo método de Romanowsky e observados em microscopia de luz. Para melhorar a detecção de animais infectados, aplicou-se a reação de imunofluorescência direta (IFD) usando anticorpo policlonal anti-Leishmania produzido em camundongo. Foram comparados os dois métodos e dos 60 cães com sinais clínicos da doença, o exame direto foi positivo em 50%, duvidoso em 36,7% e negativo em 13,3%. Quando os linfonodos foram submetidos à reação de IFD observou-se reação positiva em 93,3% e negativa em 6,7%. Esses resultados mostram alta sensibilidade da IFD quando comparada à pesquisa direta do parasito no exame citológico e que apesar da grande porcentagem de infectividade dos animais, apenas metade deles pôde ser indentificada pelo método parasitológico clássico. Os resultados indicam que o parasitismo dos linfonodos ocorre em grande parte dos cães soropositivos, entretanto, a detecção pelo método parasitológico clássico é baixa, corroborando os dados
obtidos no presente estudo, no qual das 77 amostras positivas na PCR, apenas 41 foram identificadas na microscopia comum.
5.6. SENSIBILIDADE
Quando o exame parasitológico revelou-se positivo (45 cães), 44 (97,78%) foram positivos na RIFI concomitantemente, 42 (93,33%) no ELISA e 41 (91,11%) na PCR do aspirado de linfonodo. Na Tabela 7 são apresentados esses resultados.
TABELA 7 Resultados das provas RIFI, ELISA e PCR LIN R4 e LIN 19 dos
cães de Bauru, positivos no exame parasitológico direto. Botucatu 2008.
EXAME POSITIVOS PORCENTAGEM
RIFI 44 97,77%
ELISA 42 93,33%
PCR LIN R4 e LIN 19 41 91,11%
A probabilidade de resultados falsos negativos (PFN) é de 2,22%, 6,67% e 8,99% para RIFI, ELISA e PCR, respectivamente. As tabelas 8, 9 e 10 facilitam a visualização desses resultados, comparando os resultados de cada prova com o parasitológico direto. Quatro cães apresentaram resultado negativo na PCR a despeito de serem positivos no parasitológico direto. Esses resultados são compatíveis com o estudo de Andrade et al. (2006), que revelou uma situação semelhante. O parasitológico direto e a PCR de aspirado de linfonodo de 55 cães revelou que em um dos animais havia formas amastigotas, com resultado negativo na PCR. 27 foram positivos em ambas as provas e oito negativos no parasitológico direto foram positivos na PCR. No mesmo trabalho, quando se comparou a PCR com o parasitológico direto, dez (62,5%) dos animais negativos na RIFI e no parasitológico foram positivos na PCR, revelando baixa concordância entre a RIFI e PCR, porém alta concordância entre citologia e PCR, quando se utilizou o exame parasitológico direto (ANDRADE et al,. 2006).
O exame de PCR de amostras de pele, sangue e linfonodo de 95 cães, revelou um animal positivo apenas no linfonodo, cinco positivos na pele e linfonodo, porém negativos no sangue, 84 positivos em todas as provas, um negativo no linfonodo e positivo nas outras duas, e quatro positivos no sangue e linfonodos e negativos na pele. Concluiu-se que apenas um animal não foi positivo na PCR de linfonodo, enquanto que quatro deles foram negativos na pele e seis no sangue, revelando que este tipo de tecido apresenta sensibilidade elevada (MANNA et al, 2004).
TABELA 8 Distribuição dos resultados da RIFI dos cães de Bauru segundo
exame parasitológico direto. Botucatu 2008.
TABELA 9 Distribuição dos resultados do ELISA dos cães de Bauru segundo
exame parasitológico direto. Botucatu 20088.