Outra comparação foi realizada entre plantas de tomateiro suscetível Santa Clara infectado com ToCMoV e suas plantas controle (interação de suscetibilidade). O objetivo dessa análise foi tentar compreender os mecanismos envolvidos no processo de infecção que favoreçam o begomovírus ToCMoV em sua planta hospedeira. E pela primeira vez, foi demonstrado o perfil proteico de plantas de tomateiro suscetível Santa Clara infectados com ToCMoV.
A análise do perfil proteômico do tomateiro suscetível infectado com ToCMoV revelou que proteínas associadas a diferentes processos biológicos, como a ubiquitinação,
- 77 -
dobramento proteíco, fotossíntese e tradução foram afetados. Esses processos podem indicar os mecanismos virais que contribuem para a infectividade de ToCMoV (Figura 2.7).
Entre as proteínas identificadas está a ubiquitina. Essa proteína não foi visualizada no tomateiro resistente LAM 157 infectado com esse begomovírus. Sabe-se que a ubiquitina é uma proteína que se liga a proteínas-alvo (ubiquitinação), mediando a proteólise de importantes proteínas celulares envolvidas em reposta a estresse, ciclo celular, regulação transcricional, reparo de DNA, entre outros (Glickman e Ciechanover, 2002). Foi mostrado que as vias de ubiquitinação são alvos de vírus de planta em benefício próprio através de diferentes mecanismos (Alcaide-Loridan e Jupin, 2012). Diversos trabalhos envolvendo proteínas de geminivírus têm sido relatados, mostrando a diversidade dos mecanismos utilizados por esses vírus. Várias proteínas virais como, C4, C2, βC1 e Rep interagem com proteínas do hospedeiro, incluindo proteínas envolvidas no processo de ubiquitinação (Castillo et al., 2004; Eini et al., 2009; Lozano-Duran e Bejarano, 2011; Lozano-Durán, Rosas-Díaz, Gusmaroli, et al., 2011; Sánchez-Durán et al., 2011; Zhang et al., 2011). Mais recentemente, foi mostrado queo fator de patogenicidade AC2 (C2, AL2 e TrAP) do begomovírus TocMoV é capaz de ativar a expressão da proteína SGT1 (Carmo et al., 2013), proteína que interage com complex SCF (SKP1–Cullin–F-box) da E3 ubiquitin ligase (Zhang et al., 2008). Com base nesses resultados, é provável que proteínas virais do ToCMoV estejam interagindo com proteínas associadas com o processo de ubiquitinação na tentativa de garantir o avanço da infecção. A ubiquitina foi também encontrada somente nas plantas- controle não inoculadas de plantas LAM 157, não sendo regulada nas plantas resistentes infectadas. Isso pode indicar que essa proteína esteja sendo ativada somente para favorecer a infecção viral, como um mecanismo utilizado para driblar as vias básicas de defesa da planta hospedeira.
- 78 -
Uma proteína que parece ter um papel importante durante a infecção causada por ToCMoV foi a proteína de choque térmico 70 (HSP70), chaperona envolvida em diferentes processos celulares, como o controle das atividades de proteínas reguladoras e o reestabeleci- mento das conformações proteícas nativas sob condições de estresse (Rajan e D'silva, 2009). É bem conhecido que essas chaperonas são induzidas em plantas durante a infecção viral. Escaler et al. (2000) mostraram que o aumento de HSP70 em tecido embrionário de ervilha infectado com diferentes vírus está associado com a replicação viral. Resultados semelhantes também foram obtidos por Wang et al. (2009), que sugeriram que a HSP70 desempenha im- portantes papéis na replicação do Tomato bushy stunt tombusvirus. Lozano-Durán et al. (2011) também mostraram a importância da HSP70 na infecção causada pelo begomovírus Tomato yellow leaf curl Sardinia virus. Esses autores propuseram que um aumento dessa pro- teína é requerido para uma completa infecção viral. Além disso, foi sugerido que a interação da HSP70 com a proteína de movimento MP do begomovírus Abutilon mosaic virus é im- portante para o transporte viral e indução de sintomas em Arabidopsis thaliana (Krenz et al., 2010). Mais recentemente, Góngora-Castillo et al. (2012) mostraram que folhas de pimentão com sintomas causados pelo begomovírus Pepper golden mosaic virus apresentaram níveis induzidos do gene que codifica a HSP70. Todos esses dados corroboram o resultado encon- trado neste trabalho, no qual a HSP70 foi aumentada nas plantas de tomateiro suscetível in- fectado com ToCMoV. Pela primeira vez, foi mostrada a participação dessa chaperona duran- te a infecção causada por ToCMoV. Possivelmente, a HSP70 é recrutada para favorecer a replicação viral e o desenvolvimento de sintomas em plantas hospedeiras.
Outra proteína identificada e que pode estar associada à infectividade de ToCMoV foi a MLO-like. Essa proteína consiste de sete domínios transmembrânicos (Devoto et al., 2003) e que mostrou um aumento de expressão maior nas plantas de tomateiro suscetível infectados
- 79 -
com ToCMoV. Sob condições de estresse abiótico e biótico, a proteína MLO pode ser modulada, sugerindo sua participação em diversos processos de desenvolvimento da planta (Chen et al., 2006). Trabalhos têm mostrado que os elevados níveis de expressão gênica de MLO estão associados ao aumento de suscetibilidade de fungos fitopatogênicos. Büschges et al. (1997) propuseram que o gene Mlo é capaz de modular a resposta de defesa e morte celular em folhas de cevada infectada com Blumeria graminisf. sp. hordei. Assim como foi observado no trabalho de Kim at al.(2002). Esses autores mostraram que na ausência de calmodulina, a proteína MLO regula negativamente a resposta de defesa contra Blumeria
graminis f. sp.hordei. Zheng et al. (2013) também mostraram que o aumento de expressão
desse gene está associado ao aumento de suscetibilidade ao fungo Leveillula taurica. O presente trabalho revelou pela primeira vez o aumento da proteína MLO-like associada a infecção por ToCMoV. Baseado nestes trabalhos, é possível que essa proteína esteja sendo regulada para combater a resposta de defesa da planta hospedeira, aumentando assim, a suscetibilidade do tomateiro Santa Clara ao begomovírus ToCMoV.
Foram observadas duas proteínas associadas com a fotossíntese que foram significati- vamente moduladas, a CP43 e a proteína PsaA. Enquanto a CP43 foi modulada positivamente nas plantas de tomateiro suscetíveis infectadas, a proteína PsaA foi modulada negativamente. A CP43 faz parte do fotossistema II, dando estabilidade a esse sistema e sendo essencial na atividade de processamento do oxigênio (Bricker e Frankel, 2002). Foi relatado que plantas infectadas com a linhagem flavum do Tobacco mosaic virus mostraram níveis de expressão dessa proteína diminuídos (Lehto et al., 2003). Entretanto, Adi et al. (2012) mostraram que a proteína CP47, que também faz parte do fotossistema II (Bricker e Frankel, 2002), apresentou níveis mais elevados em tomateiro suscetível infectado com o begomovírus Tomato yellow
-
80
-
Figura 2.7. Análise comparativa entre plantas suscetíveis Santa Clara inoculadas com ToCMoV e não inoculadas (controle). O gráfico representa a razão em escala logarítma (logaritmo natural) das proteínas diferencialmente expressas nas plantas suscetíveis inoculadas com ToCMoV.
- 81 -
Diferentemente, a proteína PsaA, uma das principais subunidades que está presente no centro de reação do fotossistema I (PSI) (Golbeck, 1992) é afetada sob condições de estresse. Durante a fotoinibição do PSI ocorre adegradação das proteínas PsaA/PsaB (Ozakca, 2013). Esses dados sugerem que as proteínas fotossintéticas respondem de maneira distinta em tomateiro suscetível infectado com ToCMoV. Provavelmente, a proteína CP43 esteja sendo aumentada na tentativa de reestabelecer o PSII afetado pelo avanço da infecção viral. Enquanto que a proteína PsaA pode estar sendo degradada como consequência do estresse oxidativo causado pela infecção viral.
Foi observada também a expressão de uma proteína envolvida na tradução de proteínas, a proteína L14 que pertence ao complexo ribossomal 60S. Essa proteína foi identificada apenas nas plantas de tomateiro suscetível infetadas com ToCMoV. Estudos anteriores mostraram que uma proteína transativadora do Cauliflower mosaic virus pode interagir com as proteínas L18 e L24 do complexo ribossomal 60S para, possivelmente, permitir a tradução policistrônica do RNA viral (Leh, Yot e Keller, 2000; Park et al., 2001). Mais recentemente, Carmo et al. (2013) mostraram que plantas infectadas com PVX expressando a proteína viral AC2 do ToCMoV apresentam um aumento da proteína ribossomal L12-1a quando comparada com plantas infectadas apenas com PVX. A proteína AC2 é conhecida por transativar outros genes virais, como genes da CP e a NSP (Sunter e Bisaro, 1991; 1992). É provável que o ToCMoV esteja recrutando a maquinaria celular da planta hospedeira para favorecer o avanço viral. Isso pode ser um indicativo que a proteína ribossomal (L14) está sendo recrutada durante a infecção para permitir a tradução de proteínas virais importantes para completar o ciclo de multiplicação viral e possivelmente, isso ocorra devido a interação com a proteína transativadora AC2.
- 82 -
3.3.3. Proteínas moduladas nas linhagens de tomateiro resistente e suscetível durante a