Os inibidores de proteases são substâncias proteicas que interagem específica e reversivelmente com diferentes enzimas proteolíticas, competindo com o substrato pelo sítio ativo da enzima, formando um complexo estável que limita ou inibe completamente a atividade proteolítica da protease (RICHARDSON, 1991; GATEL, 1994; LIENER, 1994; LASKOWSKI & QASIM, 2000; TALYZINA & INGVARSSON, 2006; LINGARAJU & GOWDA, 2008). O número de inibidores de proteinases isolados e identificados até agora é extremamente grande. A maioria dos inibidores conhecidos e caracterizados está relacionado com proteinases serínicas (PRAKASH & MURTHY, 1997; ARAÚJO et
al., 2005; KATUNUMA et al., 2003; SANO et al., 2005; ISHIHARA et al., 2006; CHEVREUIL et al., 2011).
Os inibidores de serinoproteases são os mais abundantes e amplamente distribuídos em plantas (além de serem encontrados em animais e microorganismos) e estão relacionados com a regulação das proteinases endógenas durante a dormência das sementes, imobilização das proteínas de reserva, proteção contra enzimas proteolíticas de parasitas e insetos e como proteínas de reserva (XAVIER-FILHO & CAMPOS, 1989; HAQ et al., 2004; ZHAO
et al., 2005).
O provável papel dos inibidores de proteases na defesa vegetal foi investigado em 1947, quando Michael & Standish observaram que as larvas de certos insetos não eram capazes de se desenvolver normalmente sobre os produtos de soja (MIGLIOLO et al., 2010).
Estudos de sequenciamento e cristalografia de raios-X têm mostrado que esses inibidores apesar de não serem homólogos, em sua maioria, interagem por um mesmo “mecanismo padrão” e compreendem pequenas proteínas de 29 a 190 aminoácidos e possuem um loop de ligação exposto em conformações bem características (LASKOWSKI & KATO, 1980; BODE & HUBER, 1992).
Os inibidores de serinoproteases podem ser agrupados com base na similaridade estrutural, primária e tridimensional, e são classificadas em pelo menos 18 famílias; de origem animal: família Kunitz (BPTI), família Kazal, família do inibidor de Ascaris, família antileucoproteinase/Queloniana, família das serpinas, família hirudina; Vegetal: família Kunitz (STI), família Bowman-Birk, família da batata 1, família da batata 2, família do inibidor de tripsina de centeio, família do centeio; Microorganismos: família do inibidor de subtilisina (LASKOWSKI & QASIM, 2000). Nos vegetais as famílias melhor caracterizadas são Kunitz e Bowman-birk.
A família Kunitz apresenta uma ou duas cadeias polipeptídicas, em geral, com massa molecular em torno de 18 a 24 kDa, correspondendo a aproximadamente a 170 a 200 resíduos de aminoácidos, geralmente com quatro resíduos de cisteína (Cys), que formam pontes dissulfeto, proporcionando estabilidade a estrutura proteica. Em geral, estes inibidores possuem apenas um sítio reativo. Devido a esta característica estrutural, eles são conhecidos como inibidores de “uma cabeça”. Por outro lado, poucos representantes desta família foram caracterizados como inibidores que têm dois locais para duas enzimas
diferentes (RICHARDSON, 1991; OLIVA, 2000; CARLINI & GROSSI-DE-AS, 2002; SANTOS et al., 2011).
A família Bowman-Birk são proteínas globulares solúveis caracterizadas por possuírem massa molecular relativamente pequena, entre 8 e 9 kDa, com cerca de 70 a 90 aminoácidos e um alto conteúdo de resíduos de Cys, formando 7 pontes dissulfeto. Os inibidores dessa família são geralmente do tipo “duas cabeças”, ou seja, são capazes de formar complexos de estequiometria de 1:1 com diferentes proteases em sítios reativos independentes (RICHARDSON, 1991; SANTOS et al., 2011).
Os inibidores de serinoproteases são específicos para a diversidade de serinoproteases expressas nos organismos e de acordo com sua forma de interação podem ser classificadas em: inibidores canônicos, os quais interagem de forma fraca com a enzima, de maneira não covalente e bloqueiam diretamente o sítio alvo, sem alterações conformacionais; inibidores não canônicos, que constituem ligações fortes e específicas, inibindo o sítio ativo da enzima pela ligação ao N-terminal do inibidor; inibidores da subfamília das serpinas, que formam um complexo covalente acil-enzima, provocando uma forte alteração conformacional no inibidor ocasionando a quebra do sítio ativo da protease (KROWARSCH et al., 2003; OTLEWSKI et al., 2005; HWANG et al., 2009).
2.3.2. Aplicações dos inibidores de proteases
Nas plantas, como já descrito, os inibidores, apresentam papel de proteção, envolvidos em processos de defesa contra ataque de pragas e/ou patógenos e atuam também como proteínas de reserva e como reguladores de enzimas endógenas (PARK et al., 2001; LAWRENCE & KOUDAL, 2000).
Devido a ampla ação em proteases do organismo, as proteínas com atividades inibitórias são relevantes em diferentes processos fisiológicos e patológico, como coagulação (OLIVA et al., 2000), distúrbios hemorrágicos e angiogênese (SHAH & DINAPOLI, 2007), empregados em terapias anti-retroviral altamente ativa, o que tem aumentado a expectativa de vida de pacientes com HIV (ASZTALOS et al., 2006; YENI, 2006; MOLINA & HILL, 2007;) e supressão de eventos inflamatórios (FOOK et al., 2005; RIBEIRO et al., 2010).
Na biologia da reprodução a função fisiológica e bioquímica dos inibidores de serinoprotease é muito ampla, mas ao mesmo tempo não muito clara. Foi reportada a existência de inibidores de proteases nas glândulas sexuais acessórias como um protetor do tecido (LAI et al., 1991), na proteção da barreira hematotesticular, no controle de enzimas proteolíticas (MÉTAYER et al., 2002), nos mecanismos envolvidos no processo de fertilização: capacitação espermática, controlando ação sobre os receptores de cálcio (Ca+2) (BHATTACHARYYA et al., 1986).
Evidências epidemiológicas demonstram que a atividade de inibidores diminui a incidência dos principais tipos de câncer em humanos, inclusive metástase, quando esta população consome alimentos que os contenham (BARR et al., 2007; MANELLO, 2006). Dessa forma, foi verificado que eles apresentam efeito sobre a primeira etapa do processo de transformação em células tumorais. Especialmente, os da família Bowman-Birk que podem atuar em diferentes cânceres e carcinomas induzidos por agentes químicos e físicos (KENNEDY, 1998; KENNEDY & LITTLE, 1991; HUANG et al., 1999). Ainda, foi relatado efeitos de um inibidor de protease Bowman-Birk, com atividade anti-tripsina e anti- quimiotripsina - BTCI, purificado a partir de sementes de Vigna unguiculata, sobre as células MCF-7 de câncer de mama, e este apresentou efeito anticarcinogênico (JOANITTI et al., 2010).
Também foi visto que o concentrado de inibidor Bowman-Birk (BBIC), de extrato de soja é eficaz no tratamento da colite em ratos e tem sido utilizado em numerosos ensaios clínicos (LICHTENSTEN et al., 2008).
Para nutrição humana os inibidores de serinoproteases possuem muito bem relatados na literatura uma relação estreita com a propriedade antinutricional, provocando desnutrição proteica e alterações em órgãos envolvidos no processo digestivo como intestino e pâncreas (RACKIS & GUBMANN; 1982; PEACE et al., 1991; LIENER, 1994; BRUNE et al., 2010).
Apesar do estigma do inibidor proteico atuar como fator antinutricional, dependendo da dose e tempo de uso avaliações do seu efeito a partir de parâmetros bioquímicos como: (glicose (GL), triglicerídeos (TG), colesterol total (CT), lipoproteínas de alta-densidade (HDL), lipoproteínas de baixa-densidade (LDL), alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), gama
glutamil transferase (GGT), albumina, globulina, proteínas totais e proteína C reativa) e testes que garantam a digestão normal e consequentemente o aproveitamento proteico (ROY & SCHNEEMAN, 1981; SATO et al., 2002; HUANG
et al., 2008);
O inibidor de tripsina, tanto natural quanto sintético, também tem apresentado papéis importantes, bem como induzindo a redução do ganho de peso em animais e humanos por saciedade e não por desnutrição ou por prejudicar a digestão normal (McLAUGHLIN, 1983; CALAM et al., 1987; HILL et al., 1990; GARTHOFF et al., 2002; KOMARNYTSKY et al., 2011; NAKAJIMA et al., 2011; CHEN et al., 2012).
Quanto ao efeito sobre o apetite, um inibidor sintético da tripsina [N, N-dimetil- 4 - (4-guanidino-benzililoxi)-fenil acetato de metano-sulfato (DGPM)] diminuiu o consumo de alimentos diariamente de forma dose-dependente e ocasionou a diminuição do tamanho médio de refeição em ratos magros e obesos, mas a resposta foi maior nos ratos obesos (McLAUGHLIN, 1983).
Um extrato de batata (Potein) contendo 60% de carboidratos e 20% de proteínas incluindo proteínas inibidoras de tripsina foi utilizado num estudo e analisado em ratos em jejum. Potein suprimiu o consumo de alimentos por meio da secreção de CCK induzida por estimulação direta sobre as células enteroendócrinas e da inibição da tripsina luminal (NAKAJIMA et al., 2011). Em 2012, Potein®, como produto registrado (número 79075065), foi testado e comparado com outras fontes proteicas, em ratos, para avaliar o consumo alimentar e os níveis de CCK. A redução do consumo alimentos nos ratos com uso de Potein® foi maior do que os que receberam caseína ou hidrolisado de soja -conglicinina. Os níveis de CCK foram aumentados após a administração de Potein®. Este efeito supressor do apetite foi atenuado com a administração de um antagonista do receptor de CCK (devazepide). Assim, os resultados indicam que o Potein® suprimiu o consumo de alimentos em ratos e comprova que foi por meio da secreção de CCK (CHEN et al., 2012).
Ainda a adição do inibidor de proteinase extraído de batata (POT II) na alimentação de indivíduos reduziu significativamente a ingestão calórica em 17,5%. Associado a este efeito foi verificado o aumento dos níveis de CCK. Estas descobertas sugerem que a CCK endógena podem ser importantes no controle
do consumo de alimentos e que o inibidor de protease podem ter potencial terapêutico para reduzir o consumo de alimentos (HILL et al., 1990).
2.3.3. Fontes de inibidores de serinoproteases
Os inibidores de serinoproteases são muito comuns no reino vegetal (XAVIER-FILHO & CAMPOS, 1989). Podendo, além das plantas, ser encontrados nos mais diversos organismos: microorganismos e animais. Nas plantas, podem ser encontrados em tecidos de reservas, tais como sementes, tubérculos, folhas e frutos (MELO et al,, 2002; ARAÚJO et al., 2004).
Um inibidor proteico com elevada atividade contra serinoprotease do tipo tripsina foi purificado a partir de sementes de tamarindo (Tamarindus indica L.)(ARAÚJO et al., 2005).