5.2.1 Processamento histológico
Após fixação em solução tampão de aldeído fórmico neutro a 10 % (formol a 40% - 100 ml, fosfato de sódio monobásico - 4g, fosfato de sódio dibásico anidro - 6,5g e água destilada -900ml) por 24 h e acondicionado em álcool 70%, o material foi
destinado à rotina histológica para inclusão em parafina (figura 6 A) e coloração por Hematoxilina de Harris & Eosina – H.E. ( figura 6 B).
A B
Figura 6 – Bloco de parafina contendo amostra da cérvix de ovelha da raça Santa Inês (A) e corte histológico transversal corado com H.E (B), observado em microscópio óptico com aumento de 100X.
Desidratação
A desidratação foi realizada através de imersão em bateria de soluções alcoólicas (1 hora em cada solução) em concentrações graduais e crescentes (80 %, 90% e 3 x 100%),visando à desidratação tecidual homogênea, pois a água não é miscível em substancias apolares como a parafina de inclusão.
Diafanização
Com o objetivo de retirar o álcool da peça (a parafina dissolve-se mal no álcool) e torná-la transparente, foram realizados 3 banhos de 1 hora em xilol.
Inclusão
Após a remoção do álcool, o tecido foi infiltrado através de três banhos consecutivos de 1 hora cada, em parafina purificada líquida (PROQUÍMIOS®), mantida
parafina endureceu formando o "bloco" de parafina contento o fragmento de tecido em seu interior.
Microtomia
Para visualização do material incluso em microscópios de luz, realizou-se cortes de 4 µm em micrótomo semi-automático (LEICA RM 2145®). Para cada bloco foram realizados 3 cortes viáveis para montagem de lâminas histológicas.
Extensão
Os cortes provenientes da microtomia (enrugados/com dobras) foram colocados em banho histológico (água a 50°C) até completa visualização da extensão. Em seguida, eles foram recolhidos (“pescados”) com uma lâmina de vidro previamente limpa com solução sulfocrômica, dispondo-o centralizado e paralelo ao maior eixo da lâmina. Posteriormente, foram colocados em suporte horizontal com fenda inclinada para secagem.
Secagem do corte e escorrimento da parafina excedente
As lâminas, de pé no suporte de madeira, foram colocadas em estufa com temperatura regulada em 58ºC por 12 horas.
Coloração
Os cortes dos tecidos apresentaram-se incolores após a microtomia. Para contrastar as estruturas teciduais, utilizou-se a técnica HE (hematoxilina-eosina). Através da visualização a olho nu foi observada uma cor rósea-azulada, indicando ocorrência da associação comum dos corantes utilizados. O processo pelo qual os corantes hematoxilina e eosina (H.E) se ligam aos tecidos ocorre devido `a presença de radicais aniônicos ou catiônicos na molécula do corante, os quais reagem através de interações eletrostáticas aos radicais de carga oposta presentes nos componentes tissulares. Assim, o corante básico interage com os componentes tissulares ácidos, que
são os radicais fosfato dos ácidos nucléicos (DNA e RNA); os radicais fosfato e carboxila dos proteoglicanos e as carboxilas presentes nos polissacarídeos ácidos (ácido hialurônico) e proteínas ácidas. Quaisquer dos componentes do tecido que reaja com um corante básico são chamados basófilos, que significa ter afinidade por bases (demonstra basofilia). Embora a hematoxilina não seja exatamente um corante básico, mas por possuir propriedades semelhantes à desses corantes, o termo basofilia é também usado quando da sua coloração. Deste modo, a coloração dos cortes por esta substância evidenciou com uma cor azul as estruturas celulares como o núcleo devido aos radicais fosfatos do DNA, o ergastoplasma devido a estes mesmos radicais presentes no RNA, as proteínas ácidas do citoplasma e algumas substâncias extracelulares como os proteoglicanos que contêm na sua estrutura glicosaminoglicanos ácidos e/ou sulfatados. O corante ácido, por sua vez, reagiu com os radicais catiônicos tissulares encontrados principalmente nas proteínas ricas em aminoácidos básicos. A coloração pela eosina, um corante ácido, evidenciou com uma cor rósea as estruturas celulares, a maioria dos filamentos protéicos do citoesqueleto, fibras colágenas, determinados tipos de grânulos dos leucócitos e as proteínas mitocondriais. As estruturas que reagem com o corante ácido são chamadas acidófilas que significa ter afinidade por ácidos (demonstra acidofilia). Quanto ao corante ácido eosina, as substâncias coradas são referidas como eosinófilas em alternância com o termo acidófilo.
Bateria de coloração
Para desparafinar o tecido foram realizados três banhos consecutivos de 5 minutos em xilol P.A. Em cada banho foram realizadas 5 agitações. Após o xilol, realizou-se bateria de re-hidratação em álcool (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) por 1 minuto em cada solução. O tecido foi colocado por 5 minutos em água corrente e posteriormente 2 minutos em solução de hematoxilina filtrada. Em seguida procedeu-se imersão em água corrente por 5 minutos, álcool 70% por 1 minuto e Eosina por 5
Montagem
Esta é a etapa final da técnica histológica, onde realizou-se a colagem da lamínula sobre o corte, com Entelan®. A lamínula impede que haja hidratação do corte pela umidade do ar ambiente, permitindo então que estas lâminas se mantenham estáveis por tempo indefinido. Após a montagem, as lâminas foram levadas à estufa (37º C) em bandejas horizontais, para secagem do adesivo.
5.2.2 Análise histológica
De cada animal foram analisadas 3 lâminas das seguintes áreas anatômicas: porção caudal (entrada pelo orifício cervical externo), porção média e uma porção cranial (próxima ao corpo uterino), totalizando 75 lâminas (25 de cada área). Realizou- se a caracterização dos tecidos presentes em cada porção utilizando as seguintes classificações:
Tecido Epitelial de Revestimento
Classificação:
• Quanto ao número de camadas de células: simples (uma só camada de
células), estratificado (várias camadas de células), e pseudoestratificado (uma única camada de células que tocam a lâmina basal mas que possuem núcleos em alturas diferentes).
• Quanto à forma das células: cúbicas (de núcleo arredondado e central),
cilíndricas ou prismáticas (com núcleo elipsóide e geralmente central) e pavimentosas (achatadas).
• Quanto à presença de vilosidades, cílios, e queratinização quando
Tecido Conjuntivo
Classificação dos tecidos conjuntivos
Realizou-se a classificação da seguinte maneira:
Tecido Conjuntivo Frouxo – Caracteriza-se pela presença abundante de substância intercelular amorfa e alta celularidade, porém é relativamente pobre em fibras, que se encontram frouxamente distribuídas.
Tecido Conjuntivo Denso - É pobre em substância intercelular amorfa, porém relativamente rico em fibras, principalmente colágenas. Quando as fibras colágenas se distribuem de maneira difusa, não-ordenada, o tecido conjuntivo denso é chamado de não-modelado. Quando as fibras colágenas se acham dispostas de forma ordenada, formando feixes compactos e paralelos, o tecido conjuntivo denso é chamado de modelado.
O tecido conjuntivo frouxo, denso não modelado e denso modelado, foram classificados de acordo com a área ocupada com suas respectivas características nos cortes observados, sendo classificados de forma semi-quantitativa de 1 a 5 onde o valor 1 é a menor faixa (área) e o valor 5 a maior. Verificou-se também a presença ou ausência de glândulas, vasos sanguíneos e nervos no tecido conjuntivo.
A análise histológica do material foi realizada em microscópio óptico Olympus® BH-2 e a fotodocumentação em microscópio ZEISS AXIOSKOP com uma câmera digital DCM35 para microscópio acoplada. As lentes oculares grande campo utilizadas foram de 10X, onde X representa o número de vezes que a ocular ampliou o objeto observado. O aumento do objeto foi determinado pela multiplicação do aumento da ocular pelo aumento correspondente da objetiva. Foram utilizadas as lentes objetivas de 4X, 10X, 40X e 100X. Para a objetiva de 100X utilizou-se o óleo de imersão. Uma gota foi colocada em cima da lâmina e a objetiva foi abaixada até que tocasse a gota. Uma vez em foco, o óleo agiu como uma ponte entre o vidro da lâmina e o vidro da
5.3 ETAPA 3
5.3.1 Análise Estatística
Os dados foram analisados através da análise de variância, usando o procedimento GLM (General Linear Model) com o grupo e anel como fatores fixos. Diferenças entre as médias significativas foram comparadas usando o teste de Tukey (p < 0,05). As correlações entre as características foram estimadas usando o procedimento CORR do software Statistical Analysis System ( SAS, 2001 - SAS® ). As características incluíram idade do animal (grupo), comprimento e número de anéis da cérvix de ovelhas da raça Santa Inês, perímetro de cada anel e total de fundos de saco nos anéis.
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO