As quatro espécies do complexo Sporothrix (S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii), recentemente propostas por Marimon et al. (2007), tiveram como principal base molecular para sua diferenciação o polimorfismo na sequência de nucleotídeos de um fragmento do gene da calmodulina (CAL). As sequências de nucleotídeos geradas pelo grupo espanhol no referido trabalho, estão depositadas e disponíveis para o acesso no Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index. html). A partir desta informação, realizamos a taxonomia molecular das cepas de Sporothrix spp. com base na comparação das sequências obtidas para nossos isolados com as sequências depositadas no Genbank.
3.3.1 Extração de DNA genômico de leveduras de Sporothrix spp.
Células leveduriformes dos isolados de Sporothrix spp. foram cultivadas em meio BHI ágar (DIFCO) com o pH ajustado em 8,0, a 37 °C, durante o período de 10-14 dias. As células foram coletadas com auxílio de uma alça de platina e transferidas para tubos plásticos Eppendorfs e suspensas em 1.000 µL de água
MilliQ®. A suspensão foi agitada por 10-20 segundos e então centrifugada a 14.500 rpm, 4°C, por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o procedimento de lavagem das células foi repetido ao menos 3 vezes. O pellet formado foi suspenso em 200 µL do tampão de protoplasto, incubado por 2 horas a 37 °C. A suspensão foi homogeneizada por inversão, durante a incubação, em intervalos de 30 minutos. Aos protoplastos foram adicionados 200 µL de solução de lise com proteinase K. A suspensão foi homogeneizada por inversão e incubada a 65 °C, durante 20 minutos. Após a lise celular, foram adicionados 200 µL de acetato de sódio, 5M, pH 5,4 e a suspensão foi incubada a -20 °C durante 15 minutos. Os tubos Eppendorfs foram centrifugados a 15.400 rpm, 4 °C, durante 15 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e foram acrescentados 600 µL de isopropanol. A solução foi homogeneizada por inversão e incubada a - 20 °C por 16 horas. Após a precipitação do DNA, os tubos foram centrifugados a 15.400 rpm, 4 °C, durante 15 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet formado foi lavado com etanol a 70% (-20ºC), para a remoção dos sais. O processo de lavagem foi repetido ao menos 2 vezes. Após descartar o etanol proveniente da última lavagem o pellet de DNA foi seco durante 10 minutos a temperatura ambiente. O DNA foi então ressuspenso em 98 µL de água ultra pura, 1µL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 e 1 µL de RNAse (10 µg/mL), sendo incubado a 37 °C, durante 60 minutos. O DNA foi aliquotado em tubos Eppendorfs e estocado em freezer a -20 °C até o momento do uso nas reações de PCR.
A concentração de DNA foi determinada em espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Fischer Scientific, USA) pela absorbância das preparações a 260 nm, utilizando como valor padrão 1DO = 50 µg/mL de DNA dupla fita. O grau de pureza foi avaliado pela relação DO 260/280 nm. Amostras de DNA consideradas de boa qualidade, livre de proteínas e outros resíduos apresentam relação entre 1,7 e 2,0.
A integridade do DNA genômico extraído foi verificado através de corrida eletroforética em gel de agarose 0,8%, adicionado de 1% de Brometo de etídeo (10 mg/mL). Ao gel foram aplicados 1 µL da amostra de extração concomitantemente com 5 µL do padrão de peso molecular Lambda DNA/HindIII (Invitrogen). A corrida foi realizada em tampão TBE 1X, aplicando-se uma corrente eletroforética constante de 100 V por 60 minutos. A visualização e a documentação foram realizadas em um sistema de fotodocumentação (L-Pix Touch) composto de um aparelho transiluminador UV (Loccus Biotecnologia) acoplado a uma câmera fotográfica digital (Canon, USA) utilizando-se o software L-Pix Image.
3.3.2 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Para as reações de PCR foram adicionados em um microtubo Eppendorf (200µL): 12,5 µl de PCR Master Mix 2X (Promega, USA) (contendo MgCl2, dATP,
dTTP, dCTP, dGTP e Taq polimerase), 1 µl do primer CL1 [10 ρmol/µl] e 1 µl do primer CL2A [10 ρmol/µl] (Tabela 8), 9,5 µl de água MilliQ estéril e 1 µl de DNA de Sporothrix spp. [100 ng/µl], perfazendo um volume final de 25 µL.
As reações de PCR foram incubadas em um termociclador (MyGene Series Peltier Thermal Cycler, MG96G, LongGene Scientific), com um passo inicial de 94°C por 5 minutos e então amplificadas por 35 ciclos utilizando-se o seguinte programa: 94 °C (desnaturação) por 1 minuto; 60 °C (anelamento) por 1 minuto e 72 °C (extensão) por 3 minutos. Após a ciclagem realizou-se um passo a 72 °C por 7 minutos para a extensão final. Os amplicons resultantes da reação foram homogeneizados em tampão de amostra (DNA), aplicados em gel de agarose 2%, previamente acrescido brometo de etídeo (1mg/mL), concomitantemente com 5 µL do padrão de peso molecular Low Ranger 100 bp DNA Ladder (Norgen Biotek, Canadá), e submetidos à corrente elétrica constante de 80 V por 60 minutos. Após a
corrida, procedeu-se a visualização dos amplicons em um sistema de fotodocumentação (L-Pix Touch) composto de um aparelho transiluminador UV (Loccus Biotecnologia, São Paulo) acoplado a uma câmera fotográfica digital (Canon, USA) utilizando-se o software L-Pix Image.
Tabela 8: Marcador molecular utilizado para amplificação e sequenciamento do gene da calmodulina, temperatura de anelamento e longitude do fragmento amplificado.
Região Primers Sequência (5’ a 3’) Tm Amplicon Referência CAL CL1 GA(AG)T(AT)CAAGGAGGCCTTCTC 60 °C ≈ 800 pb O’Donnell (2000) CL2A TTTTTGCATCATGAGTTGGAC
3.3.2.1 Purificação e quantificação do produto de PCR
Os fragmentos visualizados foram recuperados do gel após a eletroforese e purificados utilizando o kit Wizard®
SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA) seguindo-se as recomendações do fabricante. As amostras purificadas foram quantificadas em espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Fischer Scientific, USA) e armazenadas em freezer a -20 °C até o momento do sequenciamento.
3.3.3 Sequenciamento dos produtos de PCR
O sequenciamento de DNA a partir de produtos de PCR foi realizado no Centro de Estudos do Genoma Humano da Universidade de São Paulo (USP), utilizando-se o sistema de análise de DNA de 96 capilares MegaBACE 1000 (GE Healthcare). As reações de sequenciamento foram realizadas de acordo com o protocolo para o MegaBACE 1000, utilizando o DYEnamic ET Dye Terminator Kit
(com Thermo Sequenase™ II DNA Polimerase). As sequencias foram analisadas pelo software Sequence Analyser utilizando o Base Caller Cimarron 3.12.
3.3.4 BLAST
Para buscar similaridades com sequencias depositadas no Genbank foi utilizado o software BLAST (Basic Local Alignment Search Tool – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (Altschul et al., 1997).
Sequencias consenso foram obtidas através do alinhamento das sequencias foward e reverse utilizando-se o software DNA Baser (versão 2.91). Todas as sequencias foram analisadas automaticamente por comparação no banco de dados de sequências não redundantes (NR) do NCBI (Altschul et al., 1997). Utilizando o algoritmo BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), as sequências consenso obtidas para o amplicon do gene da Calmodulina foram avaliadas e os resultados obtidos tiveram como parâmetro de aceitação, um e-value igual ou menor que 10-3, que
confirma segundo Maranhão (2008) a obtenção de alinhamento com similaridade confiável por estar mais próximo de zero e diminui a probabilidade do alinhamento ter ocorrido casualmente.