Kjernefysisk nedrustning

4.4.1 Ensaio imunoenzimático (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay _{– ELISA)}

4.4.1.1 ELISA para a determinação de sEng

A determinação da concentração plasmática de sEng foi realizada pelo método de imunoensaio quantitativo enzimático do tipo sanduíche, empregando-se o conjunto diagnóstico QUANTIKINE® Human Endoglin/CD 105 Immunoassay – ELISA (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN), de acordo com as instruções do fabricante.

As amostras de plasma foram diluídas 1:6 antes da realização do teste.

O princípio do teste consiste na ligação da sEng presente na amostra de plasma a ser testada, ao anticorpo monoclonal específico para sEng pré-fixado na superfície de uma microplaca. Após a etapa de incubação dos padrões e das

amostras, a microplaca foi lavada para retirar os antígenos que não se ligaram e, em seguida, um anticorpo monoclonal específico para sEng conjugado à peroxidase foi adicionado. Após incubação, uma segunda lavagem foi realizada para remover os conjugados anticorpo-enzima que não se ligaram. Em seguida, o substrato tetrametilbenzidina (TMB), na presença de peróxido de hidrogênio, foi adicionado às cavidades da microplaca. A reação resultante foi observada pela formação de um produto corado e interrompida pela adição de ácido sulfúrico. A intensidade da cor produzida foi medida espectrofotometricamente em 450nm, com a correção do comprimento de onda ajustado para 540nm, e era proporcional à concentração de sEng no plasma.

A concentração de sEng de cada amostra foi obtida interpolando-se a absorbância lida em uma curva de calibração, conforme orientação do fabricante.

4.4.1.2 ELISA para a determinação de TGF-β1

A determinação da concentração plasmática de TGF- 1 foi realizada pelo método de imunoensaio quantitativo enzimático do tipo sanduíche, empregando-se o conjunto diagnóstico QUANTIKINE® _{Human TGF- 1 Immunoassay – ELISA (R&D} Systems, Inc., Minneapolis, MN), de acordo com as instruções do fabricante.

4.4.1.2.1 Ativação e diluição das amostras

Antes da realização do teste, as amostras de plasma foram ativadas pela adição de uma solução ácido clorídrico, seguida da neutralização por uma solução de hidróxido de sódio / N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfônico) (NaOH/HEPES), de acordo com as instruções do fabricante. Após a etapa de ativação, as amostras de plasma foram diluídas 1:2.

4.4.1.2.2 Realização do ensaio

O princípio do teste é o mesmo descrito para sEng, diferindo-se somente em relação ao anticorpo imobilizado na microplaca (anticorpo monoclonal anti-TGF- 1)

e à composição do anticorpo do conjugado anticorpo-enzima (anticorpo monoclonal anti-TGF- 1).

A concentração de TGF- 1 de cada amostra foi obtida interpolando-se a absorbância lida em uma curva de calibração, conforme orientação do fabricante.

4.4.1.3 ELISA para a determinação dos receptores solúveis do TNF-_α

A determinação das concentrações plasmáticas de sTNF-R1 e de sTNF-R2 foi realizada pelo método de imunoensaio quantitativo enzimático do tipo sanduíche, de acordo com as instruções do fabricante (DuoSet, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN).

4.4.1.3.1 Sensibilização e bloqueio da microplaca

Microplacas de poliestireno foram sensibilizadas com 100μL/poço de anticorpo monoclonal de captura previamente diluído. A diluição do anticorpo de captura foi realizada adicionando-se 55,5μL de anticorpo a 10,5mL de solução de tampão fosfato salino (PBS) 1x. A solução de PBS 1x contém cloreto de sódio (NaCl) 137mM, cloreto de potássio (KCl) 2,7mM, fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) 8,1mM e fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) 1,5mM em água destilada.

Após incubação a 4ºC overnight, os anticorpos não ligados foram removidos por meio de 4 lavagens sucessivas. As lavagens foram realizadas utilizando-se, em cada poço da placa, 300μL de solução de PBS 1x contendo 0,1% de Tween 20 (PBS/Tween).

Em seguida à lavagem, foi feito o bloqueio adicionando a cada poço da microplaca 200μL de solução de bloqueio contendo 1% de albumina sérica bovina (BSA) diluída em PBS 1x (PBS/BSA 1%) e, posteriormente, incubação por 2 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, a solução de bloqueio foi desprezada e a microplaca foi submetida a 4 lavagens com PBS/Tween.

4.4.1.3.2 Realização do ensaio

As amostras de plasma foram diluídas 10 vezes com solução de PBS 1x contendo 0,1% de BSA (PBS/BSA 0,1%) antes de iniciar o ensaio. Os padrões foram reconstituídos conforme instruções do fabricante, obtendo-se materiais com concentrações iguais a 30ng/mL (sTNF-R1) e 80ng/mL (sTNF-R2). Após a reconstituição, foram realizadas diluições seriadas 1:2 dos padrões para que fossem obtidos sete pontos de calibração, com concentrações de nível mais alto de 800pg/mL (sTNF-R1) e 1000pg/mL (sTNF-R2). Os padrões diluídos foram determinados em duplicata.

Em seguida, 100μL das amostras-teste ou dos padrões diluídos foram adicionados a cada um dos poços da microplaca, que ficou incubada a 4ºC

overnight. Seguindo-se à incubação, foram realizadas lavagens sucessivas com o

objetivo de retirar os antígenos que não se ligaram ao anticorpo adsorvido na microplaca. Cada um dos poços da microplaca foi lavado 4 vezes com 300 μL de PBS/Tween. A etapa subsequente do ensaio consistiu na adição de 100μL de anticorpo de detecção biotinilado diluído a cada um dos poços de reação e incubação à temperatura ambiente por 2 horas. O anticorpo de detecção foi preparado pela diluição de 55,5μL de anticorpo a 10,5mL de solução PBS/BSA 0,1%. Após a incubação, foram realizadas 4 lavagens com PBS/Tween com o objetivo de retirar os anticorpos de detecção que não se ligaram ao complexo antígeno-anticorpo de captura adsorvido à microplaca. Para a revelação da reação foram adicionados a cada poço da microplaca 100μL do conjugado estreptavidina-

horseradish peroxidase (HRP) diluído, seguida da incubação à temperatura

ambiente por 30 minutos. O conjugado estraptavidina-HRP foi preparado diluindo-se 50μL em 10,5mL de solução PBS/BSA 0,1%. Em seguida, 100μL do substrato ortofenilenodiamina (OPD) foi adicionado a cada poço da microplaca, que foi incubada à temperatura ambiente por 30 minutos e ao abrigo da luz. A reação enzimática foi interrompida pela adição de 50μL de ácido sulfúrico 1M. A intensidade da cor produzida foi medida espectrofotometricamente em 490nm e era proporcional à concentração de sTNF-R1 ou sTNF-R2 no plasma.

A concentração de sTNF-R1 ou sTNF-R2 de cada amostra foi obtida interpolando-se a absorbância lida em uma curva de calibração, conforme orientação do fabricante.