Forskeropphold ved utenlandske institusjoner

Espectroscopia de RMN tem desempenhado um papel importante na caracterização estrutural de metabólitos. Embora o RMN tenha uma baixa sensibilidade em comparação com a análise por MS, esta técnica tem muitas vantagens, tais como ser não-destrutiva, fornecer atribuição estrutural inequívoca e informações sobre isômeros e conformações e configurações moleculares por interpretação dos deslocamentos químicos e padrões de desdobramento dos sinais devido as interações nucleares mediadas por acoplamento spin-spin (J couplings).137 Assim, neste trabalho, a técnica de RMN foi utilizada para caracterizar estruturalmente o metabólito desconhecido detectado nas amostras de biotransformação do LPSF-PT-31.

Para identificar a posição correta da hidroxilação e, assim, obter a completa caraterização do metabólito do LPSF-PT-31, espectro de hidrogênio (1H-RMN) do M1 foi obtido e comparado como o espectro 1H-RMN do LPSF-PT-31 (Figura 2.11). A Tabela 2.6 resume os deslocamentos químicos e a multiplicidades do LPSF-PT-31 e M1. Em comparação ao substrato nenhuma diferença significativa nos deslocamentos químicos do grupo benzil foi observada, excluindo a possibilidade de hidroxilação no CH2 benzílico. Entretanto, três principais mudanças foram

observadas no anel imidazolidina, incluindo desblindagem do 1H a partir da ligação N-H (1a posição) de 6,19 para 6,71 ppm, a perda do sinal do CH2 (5a posição) e a

presença de um novo sinal de singleto em 4,61 ppm, o qual integra para 1H e exibe um deslocamento químico consistente com um próton ligado ao grupo C-OH. Além dos experimentos de 1H também foi feita uma tentativa de adquirir experimentos bidimensionais (COSY e HSQC), mas mesmo utilizando uma sonda criogênica não foi possível obter nenhum sinal, devido à quantidade insuficiente de massa do metabólito. Entretanto, espectros 1D-1H forneceram dados suficientes para concluir que a hidroxilação ocorreu na 5ª posição do anel imidazolidina levando à formação do 3-(2-cloro-6-fluorobenzil)-5-hidroxiimidazolidina-2,4-diona.

FIGURA 2.11 - Espectro de 1H-RMN (a) LPSF-PT-31, (b) metabólito do LPSF-PT-31. Ambas amostras foram dissolvidas em CD3CN. Condições RMN (Bruker Avance III-600): sonda criogênica de 5mm TCI 1H {13C, 15N}. Sequência de pulsos 1H RMN: 1D version NOESY sequence; supressão de água e acetonitrila: d1=2,40 s; 64.000 pontos em uma janela espectral de 12.019,23 Hz; tempo aquisição= 2,73 s; ns=256 scans.

TABELA 2.6- Deslocamento químico e multiplicidade do LPSF-PT-31 e M1

Hidrogênio  (LPSF-PT-31) Multiplicidade  (M1) Multiplicidade

1,1´ 4,77 d (1,05Hz) 4,73 d (1,07 (Hz) 5a, 5a´ 3,87 d (1,27 Hz) 4,61 s NH 6,10 largo 6,71 largo 3 (aromático) 7,28 m 7,26 m 4 (aromático) 7,35 m 7,32 m 5 (aromático) 7,12 m 7,08 m

Combinando a completa elucidação estrutural do M1 por RMN e os experimentos de LC-MSn, foi possível sugerir uma proposta de fragmentação para M1 (Figura 2.12). Onde os íons produtos m/z 241, m/z 143 e m/z 117 sugerem a eliminação de uma molécula de água [M+H−H2O]+ seguido da perda do anel

imidazolidina-2,4-diona [M+H−H2O−C3H3N2O2]+ levando a formação do íon m/z 143,

o qual é o íon produto presente também no espectro de íons produtos do LPSF-PT- 31 e leva à formação do íon m/z 117 através da perda de uma molécula de etino por intermédio do íon tropílico [M+H−H2O−C3H3N2O2−C2H2]+. Os íons produtos m/z 129

e m/z 86 sugerem a perda do grupo 2-cloro-6-fluorofenil [M+H−C6H4ClF]+ seguido da

  FIGURA 2.12 - Proposta de fragmentação para o metabólito do LPSF-PT-31 considerando a hidroxilação no anel imidazolidina.

De acordo com as condições de incubação usadas nos ensaios in vitro e a característica química e estrutural da molécula do LPSF-PT-31, esperava-se obter através do metabolismo via CYP P450 metabólitos provenientes de reações metabólicas de fase I a partir da hidroxilação da molécula no anel aromático, hidroxilação alifática, N-hidroxilação e metabólitos secundários. Todas estas possibilidades também foram exploradas durante o processamento dos dados de LC-MS e LC-MSn e nenhum outro metabólito foi detectado nas amostras de biotransformação e apenas um hidroxi-metabólito majoritário foi obtido a partir do metabolismo in vitro do LPSF-PT-31 em HLMs e em RLMs, nas condições analíticas empregadas. No entanto, estes metabólitos podem ter se formado em quantidades abaixo do limite de detecção do método de análise, apesar de os experimentos terem sido realizados em larga escala. Assim, o uso de equipamentos de espectrometria de massa providos de analisadores de massa mais sensíveis que o ion trap, por exemplo, o QTrap; e ainda, o emprego de softwares que auxiliam na otimização dos métodos de aquisição e na detecção de metabólitos, podem levar a

identificação de novos metabólitos. Resumidamente, a Figura 2.13 ilustra reação metabólica proposta para LPSF-PT-31 a partir dos estudos de metabolismo in vitro em microssomas de fígado humano e de rato.

  FIGURA 2.13 - Reação metabólica proposta para LPSF-PT-31 a partir do metabolismo in vitro em microssomas de fígado humano e de rato.

Deste modo, os dados de metabolismo in vitro do LPSF-PT-31 nas condições experimentais desenvolvidas possibilitaram a identificação de um único metabólito proveniente de uma reação de hidroxilação, sendo este o metabólito M1; 3-(2-cloro-6-fluorobenzil)-5-hidroxi-imidazolidina-2,4-diona. Infelizmente, dados do metabolismo in vivo do LPSF-PT-31 ainda não estão disponíveis na literatura para promover maiores discussões. No entanto, o perfil metabólico do LPSF-PT-31, observado nos ensaios in vitro realizados neste estudo, foi semelhante ao observado para o perfil metabólico do seu análogo, clonidina. Como observado para o LPSF- PT-31, a clonidina também sofre metabolismo de fase I e produz in vitro e em humanos, majoritariamente, o hidroxi-metabólito, 4-hidroxi-clonidina.138

O metabólito M1 identificado no presente trabalho é um composto quiral, assim os enantiômeros podem apresentar maior atividade farmacológica que o LPSF-PT-31, caso este composto seja um pró-fármaco. Ainda, os enantiômeros do M1 podem também apresentar atividades farmacológicas ou toxicológicas distintas entre si. Adicionalmente, SUDO et al. (2010)129 demonstraram através de estudos de docking que o LPSF-PT-31 apresenta uma maior afinidade que a clonidina pelo sítio ativo do adrenoceptor α2A. Este efeito foi explicado p experimentos in silico por uma

ligação de hidrogênio entre o átomo de oxigênio do grupo cetona no anel de imidazolidina do LPSF-PT-31 e o resíduo de aminoácido Ile-190 do adrenoceptor α2A. Considerando este estudo, pode-se sugerir que o metabólito M1, possivelmente

apresente uma maior afinidade ao sítio ativo do adrenoceptor α2A devido à presença

do grupo hidroxila no anel imidazolidina proveniente da reação metabólica. Portanto, avaliações farmacocinéticas e farmacológicas adicionais para verificar uma possível atividade farmacológica ou toxicológica dos enantiômeros do metabólito M1, bem como a identificação das isoformas de CYP P450s envolvidas no metabolismo do LPSF-PT-31 são necessárias a fim de determinar se o LPSF-PT-31 pode ou não ser um pró-fármaco. A síntese em larga escala do metabólito M1 está sendo realizada pelo Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), coordenado pelo Prof. Dr. Ivan da Rocha Pitta, e a separação quiral preparativa será realizada para a obtenção dos enantiômeros puros para serem empregados em estudos de metabolismo in vitro e outros ensaios biológicos posteriores.