O Hospedeiro apresenta inúmeras estratégias de resposta inata contra a Bactéria. Estas estratégias estão presentes em diferentes Hospedeiros por serem conservadas ao longo da evolução das espécies. A Bactéria, por seu turno, apresenta diferentes mecanismos de virulência e de evasão que permitem a sobrevivência e o estabelecimento de uma infeção no Hospedeiro. Estas estratégias são transversais a diversas espécies de bactérias. A presente tese de doutoramento descreve um estudo sobre o modo como o Hospedeiro perceciona e reage à Bactéria e o modo com que esta se protege de tais respostas.
O peptidoglicano (PGN) é um polímero ubiquitário da superfície das bactérias. É composto por cadeias polissacarídeas que se interligam por pontes peptídicas. A terceira posição da cadeia peptídica alberga o aminoácido mais variável dentro dos vários tipos de PGNs. Ainda assim, na maioria dos casos, encontra-se ou uma Lisina (Lys) ou um ácido diaminopimélico (DAP).
O PGN é detetado por componentes do Hospedeiro que iniciam respostas imunitárias. Estes componentes compreendem quer enzimas que degradam o PGN, quer recetores que o reconhecem e ativam cascatas imunitárias que conduzem à expressão de péptidos antimicrobianos. As “Peptidoglycan Recognition Proteins” (PGRPs) são recetores evolutivamente conservados do Sistema Imunitário Inato de Invertebrados e Vertebrados, inclusive o Homem.
O PGN é o principal componente bacteriano que inicia respostas imunitárias na mosca Drosophila melanogaster. Segundo o modelo de reconhecimento do PGN em D. melanogaster, as PGRPs possuem especificidade para os aminoácidos Lys ou DAP. A PGRP-SA, in vivo, liga-se exclusivamente à Lys e a PGRP-LC ao DAP.
10 Os Grupos de Investigação que participaram no presente trabalho1, verificaram anteriormente que as bactérias apresentam componentes à sua superfície que impedem o reconhecimento do PGN com consequências na sobrevivência da mosca [1], [2]2. Os ácidos teicóicos da parede das bactérias Gram-positivas (WTA – “Wall teichoic acids”) são polímeros de fosfato que impedem o reconhecimento do PGN pela PGRP-SA por comporem uma camada que impede o acesso da proteína ao ligando [1]. A “major autolysin” Atl, cliva o PGN para promover a duplicação e a divisão da célula. Na ausência do Atl, a bactéria acumula à sua superfície fragmentos de PGN que são reconhecidos pela PGRP-SA o que resulta na sobrevivência da Mosca.
Pelo lado da bactéria, o meu trabalho de doutoramento teve dois objetivos: 1) avaliar se o efeito dos WTA é um mecanismo bacteriano conservado que permitem a evasão do reconhecimento do PGN; 2) se outras autolisinas impede o reconhecimento do PGN pela PGRP-SA como mecanismos de evasão. Concomitantemente, procurei averiguar a capacidade discriminatória da PGRP-SA e da PGRP-LC ao PGN. Por que motivo estes recetores centrais à resposta antibacteriana, encontram-se limitados na deteção devido à especificidade a uma molécula? Com o avançar do trabalho, os resultados obtidos levantaram a hipótese de que a PGRP-SA participa em respostas celulares. Com efeito, o trabalho culminou com o objetivo de avaliar a função da PGRP-SA no processo de fagocitose.
1Filipe Lab, Laboratory of Bacterial Cell Surfaces and Pathogenesis, Instituto de Tecnologia
Química e Biológica António Xavier, Universidade Nova de Lisboa.
Lygoxygakis Lab, Laboratory of Cell Biology, Development and Genetics, Department of Biochemistry, University of Oxford.
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[1] M. L. Atilano, J. Yates, M. Glittenberg, S. R. Filipe, and P. Ligoxygakis, “Wall teichoic acids of staphylococcus aureus limit recognition by the drosophila peptidoglycan recognition protein-SA to promote pathogenicity,” PLoS Pathog., vol. 7, no. 12, 2011. [2] M. L. Atilano, P. M. Pereira, F. Vaz, M. J. Catalão, P. Reed, I. R. Grilo, R. G. Sobral, P.
Ligoxygakis, M. G. Pinho, and S. R. Filipe, “Bacterial autolysins trim cell surface peptidoglycan to prevent detection by the drosophila innate immune system,” Elife, vol. 2014, no. 3, pp. 1–23, 2014.
11 As conclusões do trabalho constante nesta tese pedem que a comunidade científica reconsidere o modelo atual de reconhecimento das bactérias e intensifica a importância das respostas imediatas celulares como primeira linha de defesa, seguidas pelas respostas prolongadas e protetoras humorais. O trabalho aqui presente demonstra ainda que o reconhecimento do PGN é crucial para a ativação de respostas imunitárias celulares e humorais eficientes contra as bactérias.
O meu trabalho demonstra que a PGRP-SA reconhece fragmentos de PGN que são temporariamente expostos à superfície durante a divisão das células. Por conseguinte, as autolisinas assumem um papel importante na protecção do reconhecimento desta molécula. Quando a actividade das autolisinas é comprometida de tal modo que a célula não consegue controlar a exposição do PGN durante a divisão, fragmentos de PGN recentemente sintetizados não são prontamente incorporados no polímero da macromolécula e por isso acumulam-se à superfície. Particularmente, a ausência do Atl e do Sle1 têm um forte impacto na divisão da bactéria. Com efeito, para além do Atl, também o Sle1 assume um papel importante contra o reconhecimento pela PGRP-SA. Na ausência do Sle1, há acumulação de fragmentos de PGN recentemente sintetizados na região septal que são reconhecidos pela PGRP-SA. Porém, a quantidade de PGN que é reconhecida revela-se crucial para a ativação de uma resposta eficiente. Por conseguinte, paradoxalmente, o Sle1 não contribui para a virulência da bactéria através da evasão ao reconhecimento do PGN. Por fim, eu proponho um modelo que se baseia no todo das atividades das autolisinas que eficientemente conseguem impedir que uma grande quantidade de PGN esteja acessível ao reconhecimento, sendo que o Atl assume um papel preponderante.
Eu demonstro que a PGRP-SA e a PGRP-LC reconhecem quer a Lys quer o DAP do PGN e que ambas participam nas respostas imunitárias contra os dois tipos de bactérias. Aquando da deteção do PGN, ambas as
12 PGRPs atuam como opsoninas e participam nos processos de fagocitose e degradação da bactéria. A PGRP-SA demonstrou ser uma potencial enzima lítica que atua em condições acídicas, indicando que deverá exercer atividade no fagolisosoma. Após a fagocitose, os resultados sugerem que os macrófagos seguem uma de duas estratégias para a degradação da bactéria: fagocitose-exocitose ou fagocitose-apoptose. Através da indução da apoptose, os macrófagos potencialmente podem conter as bactérias dentro dos corpos apoptóticos que serão por seu turno fagocitados. As bactérias serão eliminadas ao sofrerem uma nova fagocitose. É provável que este processo de fagocitose-apoptose se repita até se atingir a destruição total das bactérias.
Por outro lado, a degradação do PGN é essencial para a destruição da bactéria e os WTA comprometem e dificultam a clivagem do PGN. Assim sendo, os WTA atuam a dois níveis contra as defesas do Hospedeiro. Primariamente, eles impedem o reconhecimento pela PGRP-SA e PGRP-LC e, por conseguinte, a ativação do processo de fagocitose (e a indução da expressão de péptidos antimicrobianos). Quando o Hospedeiro ultrapassa esta barreira de reconhecimento, os WTA atuam contra a segunda linha de resposta que é a destruição da bactéria após fagocitose, ao impedirem a ação da PGRP-SA e PGRP-LC (e provavelmente de outros componentes).
Em suma, eu proponho um modelo de reconhecimento segundo o qual é a acessibilidade das PGRPs através da parece celular que determina o reconhecimento do PGN. Eu proponho que os WTA das bactérias Gram- positivas e a “outer membrane” das bactérias Gram-negativas são estratégias bacterianas conservadas de evasão ao Sistema Imunitário. Por fim, proponho que possivelmente os macrófagos apresentam duas vias de degradação de microrganismos: fagocitose-exocitose e fagocitose- apoptose. A ativação de uma das vias está por sua vez dependente do tipo de bactéria e de fatores que possuem que dificultam a eficiente destruição por parte dos macrófagos.
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