Os genes MOB1 são essenciais para a sobrevivência de um organismo começando de levedura até aos humanos [86],[87],[91],[92]. Em humanos há dois genes MOB1 muito semelhantes: MOB1A e MOB1B. O nosso grupo demostrou que em linhas celulares de humanos a falta de ambos MOB1A/B causa a falha na coesão dos centríolos, falha na abscisão e aumento motilidade das células [82]. O próximo passo era estudar a função de MOB1A e de MOB1B separadamente em células humanas. Para isto, foi feita a deleção dos genes MOB1A e MOB1B usando a técnica CRISPR/Cas9.
A técnica CRISPR entre muitas funções pode ser usada para criar deleção de qualquer gene de interesse. No nosso caso, foi analisada a deleção do gene a partir da inserção da sequência de interesse por método de HDR dentro do genoma no local previsto. A inserção da sequência faz disrupção durante a transcrição do gene afetado, desta maneira impedindo a função correta do gene. Neste caso concreto, tivemos três locais para MOB1A e três locais para MOB1B no genoma. Neste estudo só analisamos o primeiro local mais próximo do inicio do gene de MOB1A e de MOB1B.
O HDR ocorre em 2% dos casos quando há um corte de cadeia dupla no DNA, mas por outro lado este método facilita a seleção dos clones, porque dá às células resistência contra puromicina. Teoricamente todos os clones tratados com a puromicina que sobrevivem na placa da cultura das células são pelo menos heteroalelicos. Outro mecanismo da reparação NHEJ ocorre com a maior frequência e cria vários defeitos na genoma como mutações, deleções ou inserções. Por outro lado, a seleção é mais difícil e necessita o FACS e os anticorpos monoclonais para separar as células transfetadas e para fazer rastreio das colonias. No nosso caso, o método da seleção por FACS e anticorpos não ia funcionar devido ao grande homologia de 95% entre MOB1A e Mob1B não há nenhum anticorpo que consegue distinguir estes genes. Este método podia ser utilizado mais à frente na criação dos clones nulos duplos de MOB1A e Mob1B.
O primeiro objetivo que tive era a identificação e seleção dos clones nulos para os genes MOB1A e MOB1B. O segundo objetivo era a caracterização dos fenótipos obtidos dos clones nulos de MOB1A e de MOB1B. Neste trabalho, consegui identificar um clone nulo de MOB1A, clone RFA 2 (homoalelico para inserção), e nenhum clone heteroalelico para inserção. Para os clones do MOB1B, não identifiquei clone nulo, mas identifiquei sete clones heteroalelicos para inserção: RFB 5, RFB 7, RFB 17, RFB 18, RFB 21, RFB 111, RFB 123. A
67 reparação do DSBs por recombinação homologa acontece com menor frequência em que NHEJ. No nosso caso, a eficiência da inserção da sequência para disrupção no local de interesse dos genes MOB1A e MOB1B foi de 1.27% (1 clone nulo * 100% / 79 clones analisados). A eficiência pode ser aumentada por uso apenas de um gRNA em vez de três gRNA para cada gene. Além disso, há outras duas regiões no genoma de cada MOB1 que CRISPR afetou, ou seja, os clones que mostravam o resultado negativo para inserção no local de estudo podem ter inserção bi-alélica noutros locais. E os clones que mostravam o resultado de inserção hétero- alélico podem ser uma mistura de células que resultou por contaminação de amostras.
Foram observados vários fenótipos durante o estudo da função de MOB1A e de MOB1B.
A observação das pontes de cromatina obtidos foram no clone nulo do MOB1A (RFA 2), tal como nos clones heteroalelicos do Mob1B (RFB 123 e RFB 17). Este fenótipo parece assim resultado da deleção/inativação dos genes MOB1A e do MOB1B. A probabilidade de ser um efeito num local não especifico (offtarget) é baixa, porque as pontes de cromatina são detetadas em três clones distintos com os gRNAs desenhados para genes diferentes.
A origem do aparecimento das pontes de cromatina não foi analisada devido ao fim do prazo da dissertação. A existência de pontes de cromatina sugere que a célula falhou num dos passos da separação dos cromatídeos irmãos, ou seja, estes estão ligados entre duas células. Uma das possíveis razões da falha da separação dos cromatídeos é ativação da via NoCut [108]. A via NoCut impede o corte final da membrana durante a citocinese que forma duas células filhas separadas. A inibição do corte pode ser provocada por causa dos cromossomas em atraso que recrutam a Aurora B [108]. A Aurora B junto com Boi1 e Boi2 funcionam como inibidores abscisão [108]. O próximo passo necessário é descobrir se a origem do aparecimento das pontes de cromatina é provocada por Aurora B ou não. A resolução dos erros que levam ao aparecimento das pontes de cromatina é critico para a célula. Este defeito significa que a célula mesmo tendo os erros no DNA avançou na mitose. O MOB1 diretamente ou indiretamente afeta um dos checkpoints responsável por deteção de erros associados a DNA. Em levedura Mob1 interage com Cdc14 e esta interação é necessária para saída da mitose [17]. Em humanos há dois homólogos de Cdc14, são CDC14A e CDC14B. Consoante a base de dados STRING (www.string-db.org, Agosto 2017), que mostra interação entre proteínas, os MOB1A/B interagem com CDC14A/B. O CDC14A é necessário para a separação dos centrossomas e citocinese produtiva durante a divisão celular [109],[110]. Além disso, os estudos sobre a função demostram que o CDC14A é responsável por migração e adesão das células [111].
68 Outros estudos demostraram que CDC14A regula negativamente CDC25, que por sua vez controla a transição G2/M por ativação de CDK1-ciclina B [112]. Outro estudo independente mostra que CDC14B também regula transição G2/M por regulação negativa de CDC25 que afeta CDK1-ciclina B [113], ou seja, esta função ficou conservada durante a evolução. A regulação negativa do CDC14B resulta em envelhecimento rápido em ratos [114]. O mais interessante é que os CDC14A/B conseguem regular o APC, por desfosforilação do Cdh1 [115],[116] e a reparação dos DSBs [117]. Concluindo, a falta dos MOB1s pode provocar desregulação na correção dos erros no DNA e desregulação do APC, que no final resulta no avanço do ciclo celular mesmo havendo erros no DNA para corrigir.
Há três possíveis resultados que podem acontecer às células que estão ligados por pontes de cromatina. O primeiro resultado e o mais otimístico em que a célula consegue corrigir os erros associados a DNA e vai ocorrer citocinese normal. Um segundo resultado é se a célula não conseguir corrigir os erros associados a DNA e isto poderá provocar apoptose celular. E um terceiro resultado, e o pior de todos, em que a célula não consegue corrigir os erros associados a DNA e avança na citocinese e corta a ponta de cromatina. Este corte da ponte de cromatina leva a um corte de DNA inespecífico. Este corte do DNA vai mobilizar a maquinaria da correção dos cortes DBS e tentar corrigir os erros. Se a maquinaria falhar pode levar à apoptose celular ou não. Uma das possíveis consequências será a transformação das células em células cancerígenas.
Em relação aos outros fenótipos observados, as células gigantes e as células multinucleadas, proponho uma explicação. O volume das células é diretamente proporcional a quantidade de material genético, ou seja, as células que têm o dobro do tamanho têm o dobro do material genético. A célula atinge estas dimensões quando colapsa o fuso mitótico (fig. 4.1 A) e se forma um núcleo grande que tem o dobro do material genético. No caso das células multinucleadas pode ter acontecido a falha durante a citocinese, ou seja, formam-se dois núcleos distintos, mas não acontece a separação das células. (fig. 4.1 B). As células gigantes têm tamanho cerca de 10 vezes superior a tamanho das outras células (fig. 3.26). Isto sugere que houve sucessivos colapsos da mitose. Por outra palavras a célula tentou de multiplicar varias vezes, mas falhou em todas.
69 Um segundo projeto onde tive oportunidade de trabalhar foi sobre gene ASPM. O gene ASPM foi descoberto em Drosophila (ASP) e mutações do gene causam formação anormal dos fusos mitóticos [100]. Os estudos seguintes demostraram que o ASP está associado aos polos do fuso mitótico, à extremidade menos dos microtúbulos [102]. O ASP consegue interligar os microtúbulos entre si [102]. Por outro, lado a deleção do ASPM em células humanas não demostrou nenhumas anomalias durante mitose [107].
No projeto relacionado com estudo do ASPM e ASP verifiquei que o nosso stock de moscas mutantes ASP4/195 ao longo de passagens deixou de ser heteroalelico para deleção. Foi confirmado por PCR que o nosso stock perdeu o alelo 195, ou seja, stock passou de ser apenas ASP4/4. Isto parece significar que os indivíduos com deleção ASP4/4 são mais robustos do que os mutantes ASP4/195 e ASP195/195. Curiosamente, a deleção perdida ao longo das passagens é a que tira uma maior porção do gene (fig. 3.29). É possível que o tamanho do fragmento delatado influencie a robustez do animal.
Figura 4.1. Esquema ilustrativa de formação de células gigantes e multinucleadas. A – formação de célula gigante e uninucleada é a consequência do colapso de fuso mitótico. B – formação de célula multinucleada é a consequência da falha durante citocinese.
70 Como as mutações do ASP causam microcefalia em Drosophila, os nossos mutantes têm os cérebros mais pequenos do que as moscas selvagens. Quando comecei a trabalhar no laboratório usei as moscas mantidas a 25ºC e tinham o fenótipo da microcefalia confirmado por mim. Passando algum tempo a nossa incubadora avariou, e passei os stocks para 18ºC. E nesta altura notou-se que cérebros mutantes tinham tamanho normal.
A variação do tamanho de cérebro com a temperatura pode ser justificada com a variação do metabolismo. Com o aumento da temperatura aumenta o metabolismo nos animais poiquilotérmicos. Por isso esta variação de temperatura na biologia usa-se para manter os stocks de Drosophila, porque quando colocamos as moscas a temperatura 18ºC o metabolismo deles baixa, ou seja, eles consomem menos alimento e reproduzem-se mais lentamente, que torna a manutenção do stock mais barato.
Com a diminuição do metabolismo todos os processos bioquímicos no organismo ficam mais lentos e a célula tem mais tempo para corrigir os erros durante ciclo celular. Assim, é possível que na ausência do ASP e a 18ºC as células tenham mais tempo para corrigir os erros do fuso mitótico. Para testar esta hipótese pode-se fazer microscopia em tempo real e ver se as células têm mal alinhamento dos microtúbulos no inicio da mitose que com tempo ficam corrigidas.
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