Na concentração de 3 x 108 con./mL o isolado JAB 42 de Aspergillus sp. causou mortalidade de 60% de ootecas, divergindo da testemunha e do tratamento com solução de Tween 80® a 0,1%. Contudo, não diferiu dos demais tratamentos (Tabela 2).
À medida que aumentou a concentração do isolado se observou maior porcentagem de mortes. A maior mortalidade confirmada pelo fungo foi de 58% para
a concentração de 3 x 108 con./mL e divergiu da obtida nas testemunhas (sem aplicação e Tween 80® a 0,1%) e da suspensão contendo 3 x 106 con./mL do fungo. Não foi encontrada diferença da mortalidade confirmada obtida na concentração de 3 x 107 con./mL do entomopatógeno (Tabela 2). O valor encontrado supera o verificado em outro estudo, em que se obteve 31% e 23% de morte para ootecas pulverizadas com 2,5µL de calda contendo 5 x 105 conídios de M. anisopliae IP 46 e
M. robertsii IP 34, respectivamente (HUBNER-CAMPOS et al., 2013). Essa resposta
sugere que o isolado JAB 42 de Aspergillus sp. tem potencial para o uso no controle de P. americana.
A diferença entre a literatura e os resultados apresentados pode ser devida a alguns fatores. O volume aplicado no trabalho citado pode não ter sido suficiente para atingir o potencial de inóculo e, consequentemente, causar alta mortalidade da praga. Além disso, também pode haver diferenças com relação à agressividade dos isolados.
Na menor concentração testada do fungo, a eficácia do controle diminuiu, pois houve diferença significativa quanto à porcentagem de ootecas com extrusão e mortalidade pelo fungo, quando comparada com o tratamento de 3 x 108 con./mL. Se observa que a porcentagem de morte aumentou em função da concentração dos conídios. Este resultado está de acordo com a literatura. Mnyone et al. (2009) demonstram que a mortalidade de adultos de Anopheles gambiae (Giles, 1926) aumentou com o aumento de concentrações de 107 a 1010 conídios/mL de M.
anisopliae e B. bassiana.
No período médio de 20,5 dias foi possível observar a extrusão do fungo nas ootecas, principalmente no tratamento com aplicação de 3 x 108 con./mL do isolado (Tabela 2). As ootecas com o fungo extrusado serão novas fontes de inóculo do patógeno e sua disseminação ocorrerá cerca de três semanas após a aplicação, dependendo da temperatura e umidade do ambiente. Portanto, é possível inferir que, assim como outras espécies fúngicas, o isolado JAB 42 de Aspergillus sp. pode infectar outros hospedeiros mesmo duas semanas após sua aplicação (MNYONE et al., 2009).
Tabela 2. Mortalidade total de ootecas (MT), ootecas com morte confirmada pelo
fungo (MF), extrusão (EX), tempo médio, em dias, de extrusão do fungo (TMEF), número total de ninfas eclodidas (NN) e número médio de ninfas por ooteca com eclosão de ninfas (NNO) ± Erro Padrão da Média (EPM) de Periplaneta americana do município de Piracicaba – SP, pulverizadas com suspensões de diferentes concentrações (con./mL) do isolado JAB 42 de Aspergillus sp. (Asp).
Tratamentos MT (%)1 MF (%)1 EX (%)1 TMEF2 NN1 NNO1
T1- Testemunha 6,0± 2,2 c 0,01 ± 0,0 c 0,0 ± 0,0 c - 137,4 ± 3,7 a 14,6 ± 0,1 a T2- Tween 80® a 0,1% 20,0 ± 4,9 bc 0,0 ± 0,0 c 0,0 ± 0,0 c - 109,8 ± 6,1 ab 13,8 ± 0,2 a T3- Asp 3 x 108 con./mL 60,0 ± 8,0 a 58,0 ± 9,5 a 36,0 ± 6,1 a 18,0 ± 2,5 a 71,2 ± 10,8 b 13,5 ± 0,6 a T4- Asp 3 x 107 con./mL 46,0 ± 4,6 ab 46,0 ± 4,6 ab 26,0 ± 4,6 ab 21,5 ± 2,3 a 87,0 ± 8,4 b 13,6 ± 0,2 a T5- Asp 3 x 106 con./mL 34,0 ± 6,7 ab 28,0 ± 7,7 b 16,0 ± 6,1 b 22,0 ± 6,3 a 95,2 ± 11,0 b 13,9 ± 0,2 a F = 12,84** F = 34,15** F = 20,48** X2 = 1,5728NS 7,02** 1,61NS C.V. (%) 29,08 36,41 47,92 21,14 5,34
Médias ± erro padrão. Médias originais, mas análise estatística realizada com dados transformados em arcoseno √𝑥⁄ para MT, MF, EX. Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelos testes de 1Tukey (p≤0,05) e 2Log-Rank pela comparação de pares de isolados por análise de sobrevivência pelo método Kaplan-Meyer. **teste F significativo a 1%. NS: teste não significativo. C.V.: coeficiente de variação de dados transformados.
Foi observado que em 14%, 12% e 2% das ootecas com extrusão do fungo, que receberam as suspensões fúngicas dos tratamentos T3, T4 e T5, respectivamente, houve a eclosão de ninfas. Isto demonstra que o fungo é capaz de penetrar e infectar os ovos com os quais entrou em contato, mas evidencia que ele não deve ter causado asfixia das ootecas, conforme citado por Hubner-Campos et al. (2013). O isolado fúngico pode não ter tido tempo suficiente para infectar e colonizar todos os ovos da ooteca.
Não houve diferença significativa no número médio de ninfas por ooteca. Contudo, é possível observar que a aplicação do isolado JAB 42 de Aspergillus sp. na concentração de 3 x 108 con./mL reduziu em 48,20% e 35,15% o número total de ninfas, quando comparado com o número total obtido nos controles T1 e T2, respectivamente (Tabela 2), diferindo significativamente destes. Essa redução no número de ninfas eclodidas também já foi observada para fêmeas de B. germanica tratadas com suspensões de M. anisopliae (QUESADA – MORAGA et al., 2004).
Poucos estudos foram realizados tendo como enfoque o controle de ootecas (MOHAN; LAKSHMI; DEVI, 1999 e HUBNER-CAMPOS et al., 2013). O uso de fungos com o objetivo de controlar esta fase do ciclo da praga se mostra eficiente. Diante desse resultado se faz importante considerar o uso do isolado JAB 42 de
Aspergillus sp. em estudos posteriores objetivando o manejo de ovos de P. americana.
3.3. Atividade quitinolítica do isolado JAB 42 de Aspergillus sp.
O isolado foi capaz de crescer e esporular no meio com quitina, mostrando que secreta quitinase (Tabela 3). Outras espécies do mesmo gênero (SHARAF et al., 2005), bem como B. bassiana e M. anisopliae também são produtores desta enzima (PETLAMUL; PRASERTSAN, 2012; El-HUSSEINI et al., 2010).
Esta informação deve ser considerada com relação ao controle biológico de adultos de P. americana, tendo em vista que seu exoesqueleto é composto por 38% de quitina (KRAMER et al., 1991). Além disso, a quitinase tem importante papel no processo de penetração por fungos entomopatogênicos, interferindo em sua patogenicidade (PELIZZA et al., 2012).
O pico de atividade enzimática do isolado JAB 42 de Aspergillus sp. ocorreu no quarto dia de cultivo, divergindo dos dados encontrados na literatura, sendo eles de 72 horas para B. bassiana e M. anisopliae (PETLAMUL e PRASERTSAN, 2012), enquanto halos maiores indicativos de atividade enzimática por Ascomycetos anamorfos foram obtidos após 20 dias de cultivo (PELIZZA et al., 2012). Isto evidencia que o tempo para a produção da quitinase pode variar em função da espécie e consequentemente, irá interferir na patogenicidade e tempo letal do organismo alvo (PELIZZA et al., 2012).
A partir do sétimo dia de cultivo houve redução da atividade enzimática. Isto deve ter ocorrido como forma de defesa do fungo, protegendo sua parede celular (PETLAMUL e PRASERTSAN, 2012), que também é composta por quitina (DUBEY et al., 2014).
Tabela 3. Crescimento e esporulação do isolado JAB 42 de Aspergillus sp em meio mínimo contendo substrato específico
(quitina) para detecção da atividade quitinásica. Meio de
cultura
Crescimento (mm)
Esp.
4 dias 7 dias 10 dias
DC DH IE DC DH IE DC DH IE
Sem quitina 18,7 ± 0,3 b - - 50,7 ± 0,3 b - - 64,3 ± 0,7 b - - 6,21 ± 1,4 a Com quitina 14,4 ± 0,2 a 25,8 ± 0,5 0,5 ± 0,0 39,5 ± 0,4 a 41,5 ± 0,4 0,9 ± 0,0 52,8 ± 0,8 a 58,4 ± 0,9 0,9 ± 0,0 5,4 ± 0,7 a
Teste F 105,66* 321,64* 89,35* 0,15NS
C.V. (%) 4,00 2,19 3,29 19,17
Esp.: esporulação (x 108 conídios/mm2); DC: diâmetro da colônia; DH: diâmetro do halo; IE: índice de atividade enzimática. 1Médias originais, mas
análise estatística realizada com dados transformados em √𝑥 + . Médias ± Erro Padrão seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05). NS: não significativo. C.V. = Coeficiente de variação. *Teste F significativo a 5% de probabilidade.
O isolado JAB 42 de Aspergillus sp. se mostrou bom produtor de quitinase, já que apresentou expressivo valor do índice de atividade enzimática (0,56) durante o pico de secreção da enzima, podendo ser capaz de penetrar o exoesqueleto dos adultos de P. americana, uma vez que a patogenicidade está atrelada a atividade quitinolítica do fungo (PELIZZA et al., 2012).