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VEGETAIS E DURANTE ARMAZENAMENTO

A integridade química da droga vegetal foi monitorada a partir da quantificação dos teores dos derivados do ácido cinâmico (cumarina e ácido 'cumárico) e diterpenos caurânicos (ácidos benzoilgrandiflórico, cinamoilgrandiflórico e caurenóico), durante o armazenamento de amostras de folhas secas de e .

O material vegetal foi cultivado, colhido, beneficiado e armazenado conforme descrito no item 4.9.7. e foram armazenadas por um período máximo de 12 e 18 meses. Os estudos com foram interrompidos aos 12 meses porque sua continuação não era justificada, já que a instabilidade dos derivados caurânicos foi demonstrada a partir do terceiro mês de armazenamento da droga vegetal.

Durante todo período avaliado (12 meses), a cumarina (33) e o ácido 'cumárico (42) não foram detectados nos perfis cromatográficos de (Figura 54), enquanto apenas 33 estava presente em (Figura 55). Entretanto, análises da pureza espectral do pico correspondente a 33 acusaram a presença de substância co'eluída com este, a partir do sexto mês de armazenamento.

Minutos

Figura 54. Cromatogramas obtidos por CBAE'DAD para o extrato etanólico de folhas de durante armazenamento para avaliação de estabilidade de marcadores químicos. Condição cromatográfica: vide Parte Experimental, item 4.9.5.1. Programa de detecção: 0'30 min: 210 nm; 31,0'32,4 min: 230 nm; 32,5'34,0 min: 270 nm; 34,1'38,0: 210 nm. Picos: 3, ácido benzoilgrandiflórico; 4, ácido cinamoilgrandiflórico; 5, ácido caurenóico. Legenda: T0, tempo inicial do estudo; T3, 3 meses; T6, 6 meses; T9, 9 meses; T12, 12 meses; T15, 15 meses e T18, 18 meses de armazenamento.

Os espectros no ultravioleta obtidos pelo detector de DAD na base ascendente e descendente do pico correspondente a 33 evidenciaram a presença de um produto de decomposição formado durante a estocagem da droga vegetal (Figura 56).

3 4 5 _T 0 T3 T6 T9 T12

Minutos

Figura 55. Cromatogramas obtidos por CBAE'DAD para o extrato etanólico de folhas de

durante armazenamento para avaliação de estabilidade de marcadores químicos. Condição cromatográfica: vide Parte Experimental, item 4.9.5.1. Programa de detecção: 0'30 min: 210 nm; 31,0'32,4 min: 230 nm; 32,5'34,0 min: 270 nm; 34,1'38,0: 210 nm. Picos: 2, cumarina; 3, ácido benzoilgrandiflórico; 4, ácido cinamoilgrandiflórico; 5, ácido caurenóico. Legenda: T0, tempo inicial do estudo; T3, 3 meses; T6, 6 meses; T9, 9 meses; T12, 12 meses; T15, 15 meses e T18, 18 meses de armazenamento. T0 T3 T6 T9 T12 T15 T18 3 4 5 2

O perfil espectral da impureza detectada na porção ascendente do pico é similar ao do ácido 'cumárico (42) (Figura 56); porém, não é descartada a possibilidade de ser o ácido melilótico (69), que apresenta espectro no UV semelhante. Os ácidos 'cumárico e melilótico apresentam máximos de absorção espectral no ultravioleta de 274 nm em etanol (STOKER; BEBBIS, 1962).

OH

COOH

69

Figura 56. Espectros no ultravioleta registrados pelo detector de DAD na porção ascendente e descendente do pico da cumarina nos cromatogramas da Figura 55. Legenda: T0, tempo inicial do estudo; T3, 3 meses; T6, 6 meses; T9, 9 meses; T12, 12 meses; T15, 15 meses e T18, 18 meses de armazenamento. e R, ácido 'cumárico de referência.

T0 T3

T6 T9

T12 T15

A presença marcante do contaminante foi evidenciada nas amostras com 12 meses de armazenamento (Figura 56).

A quantificação da cumarina durante o período avaliado (18 meses) não mostrou diferenças estatatisticamente significativas ( > 0,05) nos teores dessa substância (Figura 57). Esse fato pode ser explicado pela integração conjunta do pico da cumarina e do contaminante (42 ou 69).

Figura 57. Teores médios (%) dos marcadores químicos em folhas de cultivadas sob diferentes níveis de sombreamento e armazenadas para avaliação de estabilidade de marcadores químicos. Legenda: T0, tempo inicial do estudo; T3, 3 meses; T6, 6 meses; T9, 9 meses; T12, 12 meses; T15, 15 meses e T18, 18 meses de armazenamento. As médias seguidas de mesma letra nos diferentes níveis de sombreamento, não diferem entre si pelo teste de Scott'Knott ( 5 0,05) ( = 6).

A hipótese de degradação da cumarina por abertura do anel lactônico é respaldada por trabalhos anteriores, que demonstraram a conversão de cumarina em ácido melilótico, em folhas de B. (trevo'branco) e folhas de !! B (trevo'amarelo)

(STOKER; BEBIS, 1972; KOSUGE; CONN, 1962; KOSUGE; CONN; 1959). A seqüência das transformações químicas propostas por esses autores está representada na Figura 58. Adicionalmente, a presença de lactonoidrolases (lactonases), enzimas que catalisam a hidrólise reversível de lactonas a hidroxiácidos, já foi relatada em microorganismos, incluindo fitopatógenos (SHIMIZU, , 1992; KATAOKA , 2000; HONDA, , 2002).

OGlicCOOH _{O O} glicosídeo do ácido cumariníco cumarina OH COOH ácido melilótico OGlic COOH glicosídeo do ácido melilótico

enzima dihidrocumarina hidrolase

glicosidase glicosidase

Figura 58. Seqüência de reações enzimáticas propostas para a conversão de cumarina em ácido melilótico. Adaptado de STOKER; BEBBIS, 1962; KOSUGE; CONN, 1962.

Após a colheita e durante os processos de secagem e processamento de drogas vegetais ocorre a destruição de compartimentos celulares, que pode resultar em degradação de constituintes bioativos, devido a atividade enzimática da droga (BAUMGERTEB , 2003). Esses autores isolaram uma glicosidase de partes aéreas secas de #

Moench, responsável pela conversão de rutina (70) em quercetina (66) e mostraram que a degradação enzimática de compostos biologicamente ativos pode ocorrer em vários estágios dos processos farmacêuticos.

O OH OH O _O HO O OH OH O HO OH O OH OH OH 70

Quanto aos diterpenos caurânicos não foram observadas diferenças estatísticas significativas ( > 0,05) para seus teores em durante o período de armazenamento, com exceção da concentração de ácido benzoilgrandiflórico oriunda de plantas cultivadas sob 80% de sombreamento (Figura 57). No entanto, os perfis cromatográficos obtidos indicam alterações nos picos dos diterpenos caurânicos, a partir do terceiro mês (Figura 55). A análise da pureza espectral desses picos acusou impurezas a partir do sexto mês e perda significativa da resolução entre os picos correspondentes aos ácidos cinamoilgrandiflórico e caurenóico, especialmente no nono mês (Tabela 51).

Tabela 51. Valores de resolução cromatográfica entre os picos dos ácidos cinamoilgrandiflórico e caurenóico em , durante o armazenamento da droga vegetal.

T0 T3 T6 T9 T12 T15 T18

PS 2,63 1,89 1,57 0,93 1,36 1,35 1,82

40% 2,62 1,81 1,52 0,92 1,35 1,26 1,84

80% 2,61 1,56 1,41 0,93 1,29 1,19 1,65

Legenda: Legenda: T0, tempo inicial do estudo; T3, 3 meses; T6, 6 meses; T9, 9 meses; T12, 12 meses; T15,

15 meses e T18, 18 meses de armazenamento. PS: pleno sol; 40% e 80% de sombreamento.

Resultados semelhantes foram observados para os diterpenos caurânicos nas amostras analisadas de . Conforme evidenciado pela Figura 54, a diminuição nos teores dos diterpenos caurânicos ocorreu a partir do terceiro mês, acompanhada de perda de resolução entre os picos dos ácidos cinamoilgrandiflórico e caurenóico no nono mês de análise, bem como a formação de produtos de decomposição, verificados pelos perfis cromatográficos e análises de pureza de picos (Tabela 52, Figura 59).

Tabela 52. Valores de resolução cromatográfica entre os picos dos ácidos cinamoilgrandiflórico e caurenóico em , durante o armazenamento da droga vegetal.

T0 T3 T6 T9 T12

PS 1,99 1,45 1,32 nd 1,20

40% 2,01 1,33 1,26 nd 1,14

80% 1,98 1,23 1,15 nd 1,07

Legenda: Legenda: T0, tempo inicial do estudo; T3, 3 meses; T6, 6 meses; T9,

9 meses; T12, 12 meses; T15, 15 meses e T18, 18 meses de armazenamento. PS:

pleno sol; 40% e 80% de sombreamento. nd: resolução não determinada devido alargamento das bandas.

Os espectros no ultravioleta registrados na base ascendente e descendente do pico do ácido benzoilgrandiflórico em evidenciaram transformações químicas durante a estocagem, já no terceiro mês de análise (Figura 59). Um comportamento semelhante foi observado para o pico correspondente ao ácido caurenóico em

Figura 59. Espectros no ultravioleta registrados pelo detector de DAD na porção ascendente e descendente do pico do ácido benzoilgrandiflórico nos cromatogramas da Figura 55. Legenda: T0, tempo inicial do estudo; T3, 3 meses.

Os teores dos diterpenos caurânicos em cultivada a pleno sol não apresentaram diferenças estatísticas ( < 0,05) (Figura 60). No entanto, diferenças significativas ( < 0,05) foram observadas para amostras provenientes do cultivo sob 40% e 80% de sombreamento, com exceção do ácido cinamoilgrandiflórico na última condição de cultivo (Figura 60).

A perda de resolução dos picos correspondentes aos diterpenos caurânicos, a diminuição significativa de seus teores em algumas amostras e a ausência de pureza espectral sugerem a ocorrência de transformações químicas desses compostos.

Vale ressaltar que a perda de resolução observada para os diterpenos caurânicos não resultou da perda de eficiência da coluna, pois amostras não submetidas ao armazenamento apresentaram resolução similar àquela obtida no tempo inicial do estudo (T0).

Figura 60. Teores médios (%) dos marcadores químicos em folhas de cultivadas sob diferentes níveis de sombreamento e armazenadas para avaliação de estabilidade de marcadores químicos. Legenda: T0, tempo inicial do estudo; T3, 3 meses; T6, 6 meses; T9, 9 meses e T12, 12 meses de armazenamento. As médias seguidas de mesma letra nos diferentes níveis de sombreamento, não diferem entre si pelo teste de Scott'Knott ( 5 0,05) ( = 6).

Variações nos teores de diterpenos 'labdenos em folhas pulverizadas de % $ (Burm.f.) Nees foram relatadas para droga vegetal armazenada à temperatura ambiente por períodos de 0, 3, 6, 11, 12 e 15 meses. O teor de andrografolídeo (65) diminuiu nos três primeiros meses mantendo'se constante até 15 meses. Por outro lado, o teor de 14'desóxi'11,12'didesidroandrografolídeo (63) aumentou com o tempo de estocagem, após ligeira redução no ínício do terceiro mês (PHOBPHANA , 2004). As estruturas químicas de 65 e 63 estão apresentadas no item 3.4.

O presente estudo demonstrou que a integridade química dos diterpenos caurânicos (ácidos benzoilgrandiflórico, cinamoilgrandiflórico e caurenóico) presentes nas drogas

vegetais e é afetada a partir do terceiro mês de armazenamento. A cumarina, presente apenas na segunda droga vegetal, é afetada a partir do sexto mês de armazenamento. O teor mínimo de cumarina preconizado pela Farmacopéia Brasileira IV para a droga vegetal é de 0,1%, mas não há na literatura recomendações para teores de diterpenos em guacos (F.Bras.IV, 2005). Os teores de cumarina quantificados nas amostras de , durante os 18 meses de armazenamento da droga vegetal, com exceção da maioria das amostras provenientes do cultivo sob 80% de sombreamento, variaram de 0,10% a 0,16% e estas seriam, portanto, aprovadas em procedimentos de controle de qualidade (Figura 57). Mas deve'se levar em conta que os teores determinados nesse experimento tem sua exatidão comprometida devido a perda de especificidade do método cromatográfico em amostras armazenadas por períodos superiores a 3 meses, conforme já discutido. A perda de especificidade do método, nessas condições, impossibilitou avaliar o percentual de redução do teor de cumarina e de diterpenos caurânicos nas drogas vegetais armazenadas ao longo do período do estudo.

Diante desses resultados, propõe'se que estudos de atividade biológica sejam realizados com drogas vegetais armazenadas, a fim de verificar se as alterações químicas observadas implicariam em variações dos efeitos farmacológicos.