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espermática por mL e por dose inseminante

A alta diluição dos espermatozóides, como ocorre durante a separação espermática por

citômetro de fluxo, por exemplo, pode reduzir a sua motilidade e viabilidade. Esses efeitos podem ser minimizados pelo uso de um meio apropriado de diluição e coleta, contendo sais balanceados, fontes de energia, gema de ovo e algumas proteínas. Essa alta diluição, que envolve a remoção do plasma seminal, também desestabiliza as

membranas espermáticas, tendo como conseqüência a capacitação dos espermatozóides. Esta capacitação pode ser revertida no sêmen do varrão, pela inclusão do plasma seminal ao meio utilizado para a manipulação do sêmen (Maxwell e Johnson, 1999).

As alterações as quais são submetidos os espermatozóides quando o sêmen é diluído, tem sido consideravelmente estudadas. A monta natural envolve a deposição de um grande número de espermatozóides em um alto volume de plasma seminal. Quando o sêmen é processado para a inseminação, o número de espermatozóides e a proporção de plasma seminal em cada dose de sêmen é consideravelmente reduzida (Kirkwood et al., 2008).

A diluição dos espermatozóides de mamíferos com pequenos volumes de solução salina fisiológica, ou outras soluções isotônicas, produz uma ativação ou excitação da motilidade. Entretanto, se a diluição for excessiva, há uma perda permanente da motilidade, da atividade metabólica e da capacidade fertilizante in

vivo, conhecidos como “efeito diluição”

(Mann, 1964). O autor ainda sugere que o mecanismo de inativação espermática devido à excessiva diluição, assemelha-se à uma senescência da célula espermática durante o armazenamento, como um resultado do choque pelo frio, devido a evidência de que tais tratamentos certamente resultam na desestabilização das membranas espermáticas e danos em sua função.

Considera-se ótima uma taxa de diluição (sêmen:diluidor) de 1:10 (Martin Rillo et al., 1994) ou entre 1:5 e 1:15 (Ruvalcaba, 1994), dependendo da concentração espermática do ejaculado. Sobre o assunto, Johnson et al. (2000) citam que normalmente a taxa de diluição do sêmen não ultrapassa a de 1:10. As doses

inseminantes que têm pequena taxa de diluição, ou seja, menor que 1:5, apresentam baixa viabilidade espermática devido à carência de substratos energéticos e à perda da capacidade tamponante do meio (Flowers, 1996). Alexpoulos et al. (1996) observaram decréscimo significativo da motilidade espermática em doses inseminantes com menor diluição (5x109 de sptz/dose inseminante) quando comparada à de doses apresentando maiores taxas de diluição (1x109 ou 3x109). Os autores atribuíram o fato ao pobre ambiente metabólico gerado nas doses com menor diluição. Por outro lado, a razão pela qual ocorre uma redução da fertilidade e viabilidade espermáticas nas doses inseminantes submetidas a uma alta taxa de diluição (>1:15) não é totalmente explicada, embora possa estar relacionada a um fenômeno chamado choque osmótico (Flowers, 1996; Levis, 1997). Almond et al.(1994) estabeleceram que o sêmen suíno diluído, deve ter no mínimo 1,5 x 109 e no máximo 6,0 x 109 de espermatozóides/dose inseminante, em um volume mínimo de 50 mL.

Segundo Levis (1997), a taxa ótima de diluição também depende das características físicas do diluidor utilizado, tais como pH, pressão osmótica e capacidade tamponante. Quando diluidores de longa duração, como o MR-A, são utilizados, a taxa ideal de diluição é de 1:8 a 1:15 (Ruvalcaba, 1994). No entanto, utilizando-se o diluidor de Kiev, esta taxa deve oscilar entre 1:7 e 1:11 (Perez Marcos et al., 1991).

De acordo com Catt et al. (1997), a diluição do sêmen do varrão e do carneiro no diluidor BTS, poderia manter a viabilidade dos espermatozóides com ou sem a adição do plasma seminal. Diante disso, pode ser que metabólitos simples ou componentes iônicos, seriam os componentes mais importantes do plasma seminal para a

manutenção da viabilidade espermática, inclusive mais importantes que as proteínas.

Portanto, o “efeito diluição” dos

espermatozóides poderia ser minimizado pelo uso de um meio isotônico contendo sais balanceados e fontes de energia (Mann e Lutwak-Mann, 1981).

Ashworth et al. (1994) demonstraram que os espermatozóides do carneiro morreram rapidamente após uma extensiva diluição, na ausência de plasma seminal, mas que a motilidade foi substancialmente mantida quando o meio de diluição foi suplementado com cerca de 10% de plasma seminal homólogo.

O efeito do plasma seminal sobre a capacidade fertilizante dos espermatozóides necessita ser considerado separadamente da ativação da motilidade (Maxweel e Johson, 1999). Assim, o plasma seminal de diferentes machos pode ter efeitos variáveis tanto na motilidade como na fertilidade dos espermatozóides, como demonstrado em touros por killian et al. (1993).

Entretanto, os vários estudos que avaliaram os efeitos do plasma seminal sobre a fertilidade dos espermatozóides são conflitantes. Desta forma, a variação na presença, ausência ou na concentração de certos componentes, provavelmente proteínas, no plasma seminal, devem ser responsáveis pela variabilidade desses efeitos na fertilidade espermática (Maxweel e Johson, 1999).

Observa-se que a maioria do plasma seminal não acompanha os espermatozóides durante sua ascensão ao local de fertilização no trato reprodutivo feminino, sugerindo que sua remoção é necessária para a aquisição da capacidade fertilizante, e deve ser um importante fator no processo de capacitação (Maxweel e Johson, 1999).

Há considerável evidência de que processos tais como a diluição, incubação,

resfriamento, separação por citômetro de fluxo e o congelamento/descongelamento alteram a função dos espermatozóides, devendo alguns desses efeitos estarem associados à remoção do plasma seminal. Estas alterações funcionais permitem que os espermatozóides adquiram a capacidade imediata de fertilizar oócitos in vitro, ou in

vivo após a deposição próximo ao local de

fertilização (Rath e Niemann, 1997; Rath et al., 1997; Seidel et al., 1997), embora, com redução de sua longevidade, possivelmente, resultando em morte prematura dos espermatozóides quando depositados à uma distância do local de fertilização (Gillan e Maxwell, 1999).

Neste contexto, Catt et al. (1997) demonstraram que a adição de 10% de plasma seminal do carneiro ou varrão ao meio de diluição, aumentou a motilidade e viabilidade dos espermatozóides que haviam sido diluídos 400 ou 20 vezes, respectivamente, embora esse efeito benéfico tenha dependido do tipo de diluidor. O efeito benéfico do plasma seminal foi mais freqüentemente refletido por um aumento da motilidade espermática. Ainda, a utilização do plasma seminal heterólogo (dentro de cada espécie) foi geralmente prejudicial. Finalmente, os mesmos autores enfatizam que o aumento da viabilidade observada nos espermatozóides do carneiro, após a adição do plasma seminal, foi em parte, devido à redução da proporção de células aglutinadas.

Atualmente, o volume da dose inseminante mundialmente utilizado em suínos varia entre 80 a 100 mL, visando-se assegurar o transporte de número suficiente de espermatozóides para a junção útero- tubárica. Entretanto, o volume da dose inseminante pode ser reduzido por influência da raça ou do local de deposição do sêmen. Assim, Almond et al. (1998) estabeleceram que o volume mínimo da dose inseminante deve ser de 50 mL.

Do ponto de vista fisiológico, é razoável supor que existem duas características básicas que são diretamente responsáveis pela influência do varrão sobre o tamanho da leitegada: o número de espermatozóides inseminados e a proporção destes que podem fertilizar os oócitos com sucesso. A capacidade fecundante das células espermáticas está freqüentemente relacionada à qualidade dos espermatozóides e pode ser estimada através de vários parâmetros (Flowers, 2002).

Inicialmente, quando o número de espermatozóides inseminados é baixo, reflete-se em um prejuízo na fertilidade. Com o aumento do número de espermatozóides por dose inseminante, observa-se um aumento positivo da fertilidade. Entretanto, a magnitude dessa resposta diminui, gradualmente, na medida em que o número de células inseminadas é aumentada, até atingir um limite máximo (Flowers, 2002). Salisbury e Vandemark (1961) referiram essa relação como curva ou padrão de fertilidade. De acordo com os autores, a partir desse limite máximo (platô), o aumento da concentração espermática por dose inseminante, não afetará a fertilidade, em virtude da população de espermatozóides presentes no reservatório espermático, necessários para concluir o processo de fertilização, já ser suficiente.

A concentração espermática/dose inseminante é a variável mais influenciada pelos diferentes locais de deposição do sêmen. Em bovinos por exemplo, normalmente a inseminação é realizada no corpo do útero com uma dose de 20 x 106 de espermatozóides. Isso significa que em torno de 1000 vacas poderiam ser inseminadas a partir de um único ejaculado, o que tornou a prática comercialmente viável. No caso dos suínos, a inseminação comercial utiliza uma dupla inseminação,

com cerca de 3 x 109 de espermatozóides por dose. Se cada varrão produz entre 20-75 x 109 de espermatozóides por ejaculado, há quantidade suficiente para inseminar aproximadamente 12 fêmeas, quando se utiliza sêmen resfriado. Quando se trata de sêmen criopreservado, entretanto, o número de fêmeas que podem ser inseminadas é ainda mais reduzido. Considerando-se que apenas a fração rica em espermatozóides do ejaculado é coletada e que o número de espermatozóides necessários por dose aumenta para cerca de 5 x 109 por dose inseminante, apenas cinco fêmeas poderiam ser inseminadas por ejaculado, um número indiscutivelmente pequeno, considerando- se o limite inferior. Ao considerar-se ejaculados com aproximadamente 60 x 109, cerca de 20 e 12 doses seriam produzidas quando do uso do sêmen diluído e resfriado ou congelado, respectivamente.

De acordo com Watson e Behan (2002), as novas técnicas que utilizam cateteres desenvolvidos para a IIU permitem reduzir a dose para 1 x 109 espermatozóides utilizando sêmen fresco. Já com os cateteres para a IIP com sêmen fresco, a dose pode ser reduzida para 50 x 106 de espermatozóides (Martinez et al. 2002), ambos sem comprometimento da fertilidade. Utilizando sêmen congelado com a técnica de IIP, Roca et al. (2003) reduziu a dose de 6 para 1 x 109 de espermatozóides sem comprometer a taxa de parto ou tamanho da leitegada.

No entanto, há evidências para reforçar o conceito de que machos apresentam diferentes padrões de fertilidade com base no número de espermatozóides inseminados, e que há diferença entre os indivíduos. Duas hipóteses centrais para a existência de padrões de fertilidade, são que os machos diferem quanto ao seu potencial de fertilidade quando o mesmo número de espermatozóides são inseminados e que

espermatozóides inseminados aumenta-se a fertilidade em alguma parte da curva de fertilidade (Flowers, 2002).

Johnson et al. (1981, 1982) realizaram dois estudos e demonstraram claramente que a fertilidade dos machos é diferente quando utiliza-se doses inseminantes com o mesmo número de espermatozóides. Em ambos os estudos, doses contendo 3 x 109 de espermatozóides foram utilizadas para inseminar as porcas uma vez entre 12 e 24 h após o início do estro. A variação média do tamanho da leitegada, entre 24 varrões avaliados, foi de 8,8 a 12,2 leitões. Estes dados fornecem evidências de que a fertilidade do varrão, mensurada pelo tamanho da leitegada, pode variar consideravelmente entre indivíduos diante de uma mesma concentração espermática por dose inseminante.

Ao contrário dos trabalhos citados anteriormente, Xu et al. (1998) não observaram diferenças entre varrões, embora houvesse um efeito positivo do número de espermatozóides inseminados sobre o tamanho da leitegada. Foram utilizadas doses contendo 2 ou 3 x 109 de espermatozóides, oriundas de seis varrões, sendo as fêmeas suínas inseminadas três vezes durante dois dias de estro. A variação média no tamanho da leitegada encontrada pelos autores, foi de 10,2 a 11,5 quando as doses inseminantes continham 3 x 109 de espermatozóides, e entre 9,1 e 10,1 leitões quando 2 x 109 de espermatozóides/dose inseminante foram utilizados. Houve um efeito da dose inseminante sobre o tamanho da leitegada, mas nenhum interação entre dose inseminante e varrão.

Em resumo, três conclusões a respeito da relação entre tamanho de leitegada, individualidade dos varrões e número de espermatozóides inseminados podem ser citadas. Primeiramente, o tamanho da leitegada difere entre varrões quando são utilizadas doses inseminantes contendo o

mesmo número de espermatozóides; o aumento do número de células espermáticas por dose inseminante, resulta em um aumento do tamanho da leitegada, para alguns varrões; e finalmente, a magnitude da resposta no tamanho da leitegada em decorrência do aumento no número de espermatozóides por dose inseminante não é o mesmo para todos os varrões (Flowers, 2002).

2.4.6 Tempo de incubação prévia do