Para caracterizar a comunidade de fungos no solo da Mata Atlântica, foram sequenciados 154.743 amplicons da região ITS do rDNA. Durante o controle de qualidade, 112.903 sequências foram descartadas por apresentarem tamanho indesejado (<360 pb) ou baixa qualidade. Foram retidas 41.836 sequências das três áreas amostradas. Deste total, 1.521 sequências foram singletons (sequências que ocorrem uma única vez em um cluster) e foram excluídas da análise, considerando- se que podem ser artefatos da técnica (TEDERSOO et al., 2010). Quatro amostras foram excluídas do conjunto para garantir homogeneidade dos dados, como descrito previamente. O número de sequências válidas consideradas na análise foi 39.152.
O número de sequências foi variável entre as áreas amostradas (ANOVA: F2,87=
18,1547; P=<0,0001) e entre as espécies de árvores sob as quais as amostras de
solo foram coletadas (ANOVA: F2,87=3,7335; P=0,0278), mas não foi
significativamente diferente entre as épocas de coleta (ANOVA: F1,88=0,0073;
P=0,9320). Por causa desses fatores e para garantir a homogeineidade de dados, cada área de coleta foi analisada separadamente.
Através de comparações com base de dados usando BLASTn, as 39.152 sequências foram classificadas em grupos taxonômicos específicos. Todas as sequências foram classificadas no Reino Fungi e não foram encontradas quimeras após a checagem manual.
O número de sequências válidas, após a remoção de sequências de baixa qualidade e tamanho inferior a 360 pb (39.152) é similar ao encontrado em outros estudos utilizando pirosequenciamento de fungos da região 18S e ITS do rDNA. Hibbett e colaboradores (2011) analisaram 10 estudos, realizados nos anos de 2009 e 2010, que utilizaram o pirosequenciamento da região 18S e ITS do rDNA de fungos de vários substratos ambientais e observaram que, em média, cada estudo resgatou 54.000 sequências, após o controle de qualidade das mesmas. O número de sequências retido, após o filtro de qualidade, variou de 4.192 a 166.000 nos estudos analisados. Esse número depende da qualidade das sequências, do
programa utilizado para a análise das mesmas, do limite de comprimento das sequências escolhido para eliminação das sequências menores, dentre outros fatores.
A maioria das sequências identificadas pertence ao sub-reino Dikarya (Ascomycota e Basidiomycota), que corresponde a 90,37% das sequências. Ascomycota foi o filo mais abundante (20.532 sequências; 52,44% das sequências), enquanto Basidiomycota foi representado por uma porcentagem um pouco menor (14.852; 37,93%). Esses resultados são similares a outros estudos de fungos de solo usando sequenciamento Sanger (SCHADT et al., 2003; CURLEVSKI et al., 2010; KLAUBAUF et al., 2010; PORRAS-ALFARO et al., 2011). As sequências também foram atribuídas a linhagens basais de fungos (subfilo Mucoromycotina), representado por 1.827 sequências (4,66%), a Chytridiomycota (247; 0,63%) e Glomeromycota (910; 2,32%) (Figura 14).
Entre as 178 famílias detectadas, Chaetosphaeriaceae (1.661 sequências; 4,24%), Nectriaceae (1.542 sequências; 3,93%) e Amanitaceae (1.113 sequências; 2,84%) foram as mais abundantes. No nível de gênero, o total de 484 gêneros foi principalmente dominado por Trichosporon (4.330 sequências; 11,05%), Cryptococcus (3858 sequências; 9,85%) e Amanita (1.113 sequências; 2,84%).
Um total de 790 sequências não puderam ser classificadas no nível de gênero usando o BLAST. A classificação no nível de espécie não pôde ser feita para 8.665 sequências (22,13%) pertencentes a 433 UTOs (23,4%). Para essas sequências, foram encontrados apenas nomes incompletos. Talvez essas sequências representem espécies que foram descritas, porém sem referências no GenBank (BROCK et al., 2009; NAGY et al., 2011). Ou ainda podem se tratar de espécies não descritas. Alguns trabalhos mostram que a maioria das sequências analisadas não puderam ser classificadas em espécies. Tedersoo e colaboradores (2010), classificaram apenas 15% das UTOs designadas até o nível de espécie, em um estudo realizado com fungos micorrízicos de uma floresta tropical. As UTOs restantes (85%) foram classificadas até o nível de gênero.
Figura 14 – Representação do percentual de UTOs atribuídas a cada filo de fungos, segundo buscas no banco de dados do NCBI
O tamanho das sequências de DNA obtidos pelo pirosequenciamento pode reduzir a resolução taxonômica e dificultar a comparação com outras sequências em bancos de dados (TEDERSOO et al., 2010). No presente trabalho, optamos pelo tamanho de 360 pb para corte das sequências. O limite do tamanho das sequências estabelecido por diferentes autores durante o passo de “trimagem” em estudos que analisam a região ITS de fungos é variável. Contudo, quanto maior o tamanho das sequências, mais acurado será o resultado de identificação e afiliação taxonômica.
O critério de identidade de sequências também varia entre estudos de
fungos. Normalmente se usa 97% de identidade para a região ITS (O’BRIEN et al.,
2005; BUÉE et al., 2009; AMEND et al., 2010; TEDERSOO et al., 2010). Tem sido mostrado que a similaridade intra-específica, com base na região ITS de fungos, varia de 99% a 76%, dependendo das espécies analisadas (NILSSON et al., 2008). Porém, foi mostrado recentemente que isolados do gênero Laetiporus apresentam
similaridade intragenômica ≤95%, com base em dados da região ITS do rDNA
(LINDNER; BANIK 2011). Contudo, o estabelecimento de uma média para a definição de UTO é necessária para estudos de diversidade de fungos com base em sequenciamento da região ITS (LENTENDU et al., 2011).
Por outro lado, discute-se muito sobre o uso de bancos de dados, questionando a busca naqueles mais populares e sem restrição para depósitos de sequências, mas que apresentam grande número de sequências de fungos, ou em bancos de dados com restrições para o depósito de sequências (mais acurados), mas que apresentam número muito menor de sequências. Em nosso trabalho,
optamos pela busca de sequências no NCBI, que é o banco de dados que apresenta o maior número de sequências da região ITS de fungos depositadas. Os resultados da busca das sequências representantes de cada UTO foram analisados considerando-se as melhores porcentagens de cobertura ou de similaridade, entre os 10 primeiros resultados do Blast, o que pode conferir maior acurácia na identificação das sequências obtidas.
Um trabalho realizado por Hibbett e colaboradores (2011) analisaram espécies novas de fungos registradas no Index Fungorum no período de 1999 a 2009 e constataram que 8.895 (74,4%) das espécies descritas recentemente não apresentam dados de sequências depositados no GenBank. Isso alerta para a necessidade de gerar sequências baseadas em espécies descritas para propósitos de identificação de espécies, já que a maioria dos trabalhos utilizando sequenciamento em larga escala tem demonstrado grande número de sequências de fungos não conhecidas devido à ausência de sequências similares nas bases de dados.