Para desenvolvimento deste trabalho foram identificados a partir do banco de dados do SUCEST (projeto Genoma da Cana-de-açúcar) treze clones (tabela 2, p. 32) envolvidos no metabolismo de purinonucleotídeos (via da síntese de novo) que é de central importância aos organismos vivos e tem sido investigada como um possível alvo para o planejamento de drogas que combatam agentes fitopatogênicos, a exemplo do que se tem feito com muitos parasitas. Enzimas desta via metabólica em plantas têm sido pouco estudadas, por isso o interesse em caracterizar uma enzima desta via presente em cana-de-açúcar e devido ao fato desta planta ser uma das mais importantes culturas cultivadas no país.
De todos os clones de cDNA selecionados apenas o clone 3 (SCACRZ3035C11) foi caracterizado. Este clone representa a enzima Fosforribosil pirofosfato sintase (PRPP sintase) que é a iniciadora da cascata enzimática da síntese de novo de purinas (fig16, p. 21) e cuja ausência impede o funcionamento de toda a via metabólica. A PRPP sintase é importante em outras diferentes vias metabólicas como a via fosfato pentose, via de recuperação de purina e pirimidina nucleotídeos, na biossíntese de coenzimas e na síntese dos aminoácidos histidina e triptofano.
O grande papel desta enzima foi o principal motivo de seleção deste clone além do fato de ter apresentado resultados positivos, do alinhamento a expressão da proteína em células de E. coli.
Um fragmento de 1194 pb foi amplificado a partir do clone de cDNA identificado no banco de dados do SUCEST como contendo a seqüência completa
do gene prs da PRPP sintase. A estratégia de amplificação empregou um oligonucleotídeo específico 5’ e um oligonucleotídeo específico promotor SP6 do vetor como oligonucleotídeo 3’. Esta estratégia permitiu assim clonar a fase aberta de leitura (“ORF”) diretamente para o vetor de expressão pCRT7 NT TOPO. Esta amplificação foi possível, pois o gene foi obtido a partir de um clone de cDNA que foi clonado direcionalmente dentro do vetor pSPORT [6] que permitiu o uso da seqüência conhecida 5’ a partir da fase aberta de leitura do gene e possibilitou também o uso do oligonucleotídeo SP6 da região promotora do vetor pSPORT [6].
A seqüência amplificada contém uma “ORF” de 984 pb, que codifica para uma proteína de 328 aminoácidos com massa molecular de 36,6 kDa (fig36, p. 74). O ponto isoelétrico determinado experimentalmente da proteína foi de 6,55 que é consistente com o pI de 6,31 predito a partir da seqüência de aminoácidos (fig53, p. 93). Estes valores de MW e pI condizem com os valores encontrados para outros organismos já estudados cujas massas moleculares dos monômeros variam de 33 a 57 kDa [69, 70].
O códon iniciador ATG do gene prs da cana-de-açúcar é precedido por 180 nucleotídeos da seqüência 5’ – UTR. Um códon de terminação TGA em fase está presente na posição 1165. Um sítio de poliadenilação com 209 nucleotídeos a partir do códon de terminação TGA é observado. Estes resultados indicam um mRNA transcrito de 1374 nucleotídeos (fig36, p. 74).
O alinhamento dois a dois da seqüência de aminoácidos da PRS da cana- de-açúcar com proteínas PRS de A. thaliana, O. sativa e S. oleracea, S. cerevisae,
açúcar apresenta 77% e 78% de identidade com a isoenzima PRS4 de A. thaliana e S. oleracea respectivamente, podendo-se dizer que a PRS da cana-de-açúcar é uma isoenzima do tipo PRS4 devido a grande identidade encontrada. A seqüência de O. sativa não tem sido identificada como isoenzima, entretanto a partir da comparação feita neste trabalho (tabela 17, p. 78) pode-se identificá-la como a isoforma PRS3, pois apresenta 79% de identidade com as isoenzimas PRS3 de A.
thaliana e S. oleracea. Já com a PRS da cana-de-açúcar a PRS de O. sativa
apresenta 73% de identidade. Analisando a alinhamento com os demais organismos verifica-se que estes valores de identidade são no máximo de 37%.
Analisando o alinhamento da PRPP sintase de cana-de-açúcar com PRS de plantas homólogas (fig37, p. 76) verifica-se a formação de dois blocos de alinhamento. O primeiro bloco constituído pelas PRS 4 e 3 de A. thaliana e S.
oleracea e a PRS de O. sativa que fazem parte das PRPP sintases das quais pode-
se sugerir serem enzimas independentes de fosfato inorgânico (Pi) para sua
atividade. Isso se explica através de experimentos realizados com a isoenzima PRS1 e 2 de S. oleracea que mostram que estas são dependentes da presença do Pi
e que suas atividades são inibidas pelo ADP, o que não acontece com as isoenzimas PRS3 e 4 que independem do Pi e são insensíveis à inibição por ADP
nas mesmas condições, apresentando desta maneira uma nova classe de isoenzimas PRS3 e 4 [36 e 47]. Esta conclusão também pode ser verificada através de trabalhos desenvolvidos com as isoenzimas PRS3 e 4 de A. thaliana confirmando esta independência ao Pi [27]. O segundo bloco apresentado pelas
PRS1, 2 e 5 de A. thaliana e S. oleracea pertencem a classe das isoenzimas dependentes de Pi . A verificação destas duas classes formando dois blocos
distintos deve-se também pela presença nítida de “gaps” que podem ser visualizados na figura 37, p. 76. A inspeção do alinhamento das seqüências revela uma alta divergência destas na região N-terminal enquanto a região C-terminal apresenta-se bastante conservada.
Essas conclusões quanto à identidade das isoformas é consistente com a reconstrução filogenética (fig38, p. 80). É interessante a identificação de um sinal de direcionamento no cloroplasto na seqüência N-terminal das isoenzimas PRS1 e PRS2 de S. oleracea e isoenzimas PRS1, 2 e 5 de A. thaliana esta observação consiste em dados experimentais obtidos com S. oleracea PRS1 e PRS2 sendo esta última sintetizada in vitro, importada e processada em cloroplastos de ervilha (Pisum sativum) [36].
A relação filogenética da PRS da cana-de-açúcar com 25 seqüências adicionais de aminoácidos de PRPP sintetases a partir de 12 organismos diferentes foi analisada (fig38, p. 80). As isoenzimas PRS1 e 2 de S. oleracea dependentes de fosfato formam um grupo com as isoenzimas PRS1 e 2 de A. thaliana juntamente com a PRPP sintetase de Synechocystis sp. indicando uma estreita relação filogenética, consistente com estas isoenzimas de plantas que possuem uma possível localização em cloroplasto já que Synechocystis sp é uma cianobactéria ancestral de plantas e algas verdes.
Um outro grupo é observado sendo constituído pelas isoenzimas PRS de fungos que se relaciona com o grupo constituído pela isoenzimas de mamíferos, que condiz com a evolução filogenética.
Em adição, um grupo de isoenzimas PRS de plantas é evidente a partir de sua filogenia. O grupo contém as isoenzimas PRS3 e PRS4 de A. thaliana e S.
oleracea independentes de fosfato inorgânico e a PRS de arroz formando um
grupo relacionado com a isoenzima PRS4 de cana-de-açúcar. Estas seqüências agrupadas sugerem que a A. thaliana, S. oleracea , O. sativa e a enzima PRS de cana-de-açúcar são também isoenzimas independentes de fosfato constituindo a nova classe das PRPP sintases.
Os 984 pares de bases do gene prs contidas no fragmento de PCR foi subclonado do vetor pCRT7 NT TOPO para expressão em larga escala. A construção do plasmídeo resultante foi seqüenciada para confirmar a fidelidade da seqüência e verificar a orientação correta com relação à região promotora. O clone 3 selecionado foi usado na transformação de células competentes E. coli BL21(DE3) pLysS. As células de E. coli transformadas, induzidas como descrito na figura 44, p. 85, produziram um alto nível da enzima PRPP sintase insolúvel, apresentando-se também
satisfatoriamente na fração solúvel. A expressão em larga escala da proteína PRS foi realizada e a PRS foi purificada a homogeneidade inicialmente por fracionamento com sulfato de amônio (fig45, p. 86) seguido pela cromatografia de afinidade em coluna Ni-NTA eluída com um gradiente contínuo de imidazol (fig46, p. 87). A purificação da PRS de cana-de-açúcar foi visualizada em várias frações separadas em SDS-PAGE corado com “Coomassie blue” (fig47, p. 88). Como mostrado a PRS expressa é eluída em 260 mM de imidazol e migra como uma proteína de 42 kDa em SDS-PAGE. Esta massa é a esperada para seqüência PRS de cana-de-açúcar contendo a cauda de hexahistidinas no N-terminal derivado do vetor de expressão. A opção de clonar do vetor pCRT7 NT TOPO é que este contém a cauda 6xHis na região N-terminal que facilita a purificação e a
torna mais rápida, apresentando também a possibilidade de clivagem desta cauda por digestão com EKMAx obtendo a proteína nativa purificada.
Para clivar a cauda de hexahistidinas N-terminal e resíduos de aminoácidos adicionais originados da construção do vetor de expressão, a digestão proteolítica com EKMax foi realizada (fig55, p. 95). A análise da seqüência primária da proteína PRPP sintase de cana-de-açúcar não indicou a presença de uma seqüência de reconhecimento interna para a enzima EKMax. Mas como mostrado na figura 55, o resultado do padrão de clivagem foi mais complexo do que se esperava. Um total de 4 bandas foram visualizadas em SDS-PAGE corado com “Coomassie”. Para determinar a identidade de cada banda fez-se necessário o seqüenciamento N-terminal de cada produto individual. As bandas marcadas em a e b na figura 56 (p. 96) são a proteína PRS não digerida e um contaminante não identificado, respectivamente. A Banda A é a enzima PRS com sua seqüência completa depois que a seqüência N-terminal do vetor foi removida resultando em uma seqüência N-terminal DPTLMEVVGAAK e uma proteína de 36,87 kDa. A banda B tem a seqüência N-terminal da enzima PRS esperada clivada corretamente (DPTLMEVVGAAK), mas migra em SDS-PAGE como uma proteína de 25,12 kDa. Esta migração corresponde à ocorrência de uma clivagem interna entre os aminoácidos 219-220 e revela uma PRS C-terminal com um fragmento 11,88 kDa. A banda C é consistente com o fragmento C-terminal clivado de 11,88 kDa e a banda B a porção N-terminal resultante a partir de um sítio de clivagem interno. Banda D no qual não é visível em toda a preparação devido a uma pequena massa molecular foi identificada como sendo a seqüência do vetor (RGSHHHHHHG) contendo a cauda hexahistidina e resíduos de
aminoácidos adicionais com massa molecular de 3,4 kDa (fig56, p. 96). Esta banda migra na fronte do gel e sua massa não pode ser verificada desta forma. Banda C aparece consistentemente como uma banda fraca, podendo ser resultado de uma pobre ligação do corante “Coomassie” devido a composição da seqüência de aminoácidos do fragmento.
Embora a presença não esperada de um sítio interno de clivagem, a enzima PRPP sintase de cana-de-açúcar sem a seqüência do vetor N-terminal foi fracionada por separação cromatográfica em coluna Superose 12 HR 10/30 com o objetivo de separar os demais fragmentos (dados não mostrados), mas não se obteve o resultado esperado apresentando um perfil cromatográfico com sua eluição visualizado em SDS-PAGE mantendo-se a proteína agrupada com os fragmentos não desejados. Provavelmente a repetição do experimento com fracionamento por troca iônica poderá separar esses fragmentos uma vez que o pI de cada fragmento é de: a – 6,22; A – 6,3; B – 5,91; C – 7,08; D – 6,27.
A proteína purificada por cromatografia de exclusão molecular (fig49, p. 89) mostra a PRS sob a forma de um homopentâmero de aproximadamente 214 kDa, consistente com as observações obtidas para outras enzimas PRS previamente isoladas. A PRS presente em seringueiras e a PRS de Giardia
intestinalis apresentam-se sob a forma de um tetrâmero de massa molecular de
200 kDa e 150 kDa com subunidades de 57 kDa e 38 kDa respectivamente [70 e 34]. A PRS de Bacillus subtilis com massa molecular de 280 kDa e subunidade de 34 kDa foi consistente com uma estrutura quaternária octamérica [35] e estudos recentes determinaram pela primeira vez a estrutura tridimensional de uma PRS como sendo um hexâmero determinando também seus domínios ligantes [33, 71].
Sabendo-se a posição do sítio ligante do cátion divalente, do motivo ligante da PRPP/Rib-Fosfato e os possíveis aminoácidos ligantes de ATP pode-se determinar as seqüências de aminoácidos correspondentes a estes domínios na seqüência de aminoácidos da PRPP sintase através do alinhamento desta com a seqüência de aminoácidos do Bacillus subtilis. Estes domínios podem ser visualizados na figura 37, p. 76.
A análise da estrutura quaternária da proteína foi confirmada pelo experimento de espalhamento dinâmico de luz que forneceu o raio hidrodinâmico de 6,04 nm. A massa molecular estimada a partir deste raio foi de 226 kDa consistente com a forma de um pentâmero apresentado pela cromatografia de exclusão molecular (fig52, p. 92).
A técnica de Dicroísmo Circular (CD) foi usada para a análise da distribuição dos componentes de estrutura secundária da proteína PRS de cana-de- açúcar (fig54, p. 94). A PRPP sintase teve verificado a sua composição de estrutura secundária em pH 7,8 apresentando um espectro caracterizado por dois mínimos um em 210 nm e outro a 222 nm e um máximo próximo a 194 nm que pode ser visualizado na figura 54. A estabilidade da proteína em função da variação de pH de 2,5 a pH 10,0 também foi analisada, apresentando uma pequena variação nos componentes de estrutura secundária principalmente em pH 2,5 que tiveram seus mínimos e máximos modificados se comparado com o espectro da proteína em pH 7,8.
A desconvolução do perfil em pH 7,8 mostrou 21% de hélice α, 30% de componentes β (folhas β paralela e antiparalela) e 49% de outras contribuições (não ordenadas e “turns”), com um desvio médio quadrático (r.m.s.d.) de 1%. A
desconvolução do espectro gerado pelo pH 10,0 mostrou valores de componentes de estrutura secundária semelhantes ao espectro desconvoluído observado em pH 7,8, ambos são compatíveis com a composição de estrutura secundária de PRS de
Bacillus subtilis [33].
No extremo de pH 2,5 os componentes de estrutura secundária obtidos foram 16% hélice α, 36% de componentes β (folhas β paralela e antiparalela) e 48% de outras contribuições e o desvio médio quadrático foi de 12%. Este alto valor do r.m.s.d. indica uma diferença estrutural significante induzida por condições extremas de pH. Através da análise de CD pode-se observar que alterações estruturais estão limitadas ao pH extremo e ocorrem abruptamente em transições de pH 3,5 para pH 2,5 e de pH 9,0 para pH 10,0. Estes resultados mostram uma interessante estabilidade da PRPP sintase de cana-de-açúcar no intervalo de pH de 3,5 a pH 9,0.
Pelas propriedades apresentadas da PRPP sintase de cana-de-açúcar incluindo sua expressão solúvel, fácil purificação e rendimento médio de 3 mg por litro de meio de cultura sugere que esta seja uma boa candidata à cristalização e determinação da estrutura por análises de difração de raios X.
Partindo-se deste princípio a proteína foi utilizada para ensaios de cristalização testando-a nos fatoriais I e II. Obteve-se a formação de precipitados amorfos em algumas condições e em outras se verificou a formação de cristais como mostrado nas tabelas 21 e 22 (p. 98). A obtenção destes cristais nos fornece um passo na resolução da estrutura tridimensional da enzima PRPP sintase de cana-de-açúcar por cristalografia de raios-X. As condições nas quais houve
crescimento de cristais estão sujeitas a refinamento dos parâmetros de cristalização.
Os resultados descritos são importantes no avanço da caracterização de proteínas PRS de plantas que atualmente são pouco descritas, incluindo a possibilidade da realização de estudos estruturais em tais enzimas. Também, temos fortes evidências filogenéticas indicando PRS homólogas aqui descrita como uma nova classe de isoenzimas independente de fosfato inorgânico para sua atividade, representando uma contribuição no estudo desta família de enzimas. Futuramente a partir da cristalização pode-se ter a primeira PRPP sintase de planta com estrutura tridimensional resolvida por cristalografia de raios-X facilitando o desenvolvimento de drogas que combatam doenças em plantas, realizar melhoramento genético e principalmente servir de estudo comparativo em pesquisas com plantas homólogas, compreendendo-se melhor como a PRPP sintase atua sobre o mecanismo da via metabólica da síntese de novo de purinonucleotídeos.