chegaram a zero, após 60 horas de resfriamento. Nas temperaturas de 15 e de 4°C, a motilidade manteve-se acima de 20% às 72 horas de armazenamento. Apesar das temperaturas de 15 e de 4°C terem sido similares entre si, mantendo a motilidade do sêmen por até 96 horas, a integridade da membrana, avaliada pelo teste hiposmótico, foi melhor conservada (p<0,05) à 15ºC.
De forma similar, Batellier et al. (1997) obtiveram melhor fertilidade com o sêmen de pôneis estocado a 15°C, em relação à temperatura de 4°C. Segundo os autores, como o “choque pelo frio” pode ocorrer na faixa de 10°C, o armazenamento a 15°C pode prevenir danos à membrana plasmática dos espermatozóides e ser, assim, utilizado para reprodutores com células mais sensíveis às mudanças de temperatura. Assim, no processo de resfriamento do sêmen, a individualidade de cada reprodutor deve ser analisada com cautela e, ainda, se as análises “in vitro” poderão ser projetadas com total confiança para os resultados “in vivo”.
Douglas-Hamilton et al. (1984) observaram que os garanhões foram uma importante fonte de variação quando do resfriamento do sêmen. Nos tempos de armazenamento entre 10 e 13 horas, as motilidades foram de 81, 75 e 72%; entre 13 e 24 horas, de 57, 65 e 70% e entre 24 e 36 horas de 52, 51 e 67 % para os garanhões 1, 2 e 3, respectivamente, sendo que o último demonstrou menor declínio geral da motilidade. Entretanto, a maior longevidade do sêmen não refletiu na fertilidade, sendo as taxas de concepção, ao primeiro ciclo, de 73% para os reprodutores 1 e 2 e de 58%, para o reprodutor 3.
No que diz respeito ao sêmen de asininos, Ferreira (1993) e Santos (1994) observaram grande variação individual entre jumentos. Neste contexto, foram observadas diferenças (p<0,05) entre jumentos e entre ejaculados do mesmo animal para as motilidades total, progressiva e o vigor, durante o armazenamento do sêmen resfriado.
A avaliação da fertilidade do sêmen resfriado foi realizada por Vidament et al. (2005), quando utilizaram o sêmen de jumento, centrifugado para a retirada do plasma seminal e,
imediatamente diluído em diluidor a base de gema de ovo (INRA82-Y), resfriado e armazenado a 4°C. Inseminações artificiais com 400 x 106 espermatozóides∕dose inseminante responderam por taxa de concepção∕ciclo de 63% (12∕19).
Para Álvarez et al. (2004) a centrifugação do sêmen não foi benéfica para a fertilidade de asininos. Doses foram preparadas para as inseminações, envolvendo a retirada ou não do plasma seminal, sendo o sêmen diluído em diluidor de leite desnatado, com 1 x 109 de células espermáticas∕dose em um volume de 10 ou 20 ml. A seguir, foram resfriadas a 15°C, e utilizadas em um período de até 24 horas decorridas da coleta. A taxa de concepção/ciclo, para as jumentas, foi de 26% e a fertilidade por estação de 41% para o sêmen resfriado. Taxas de concepção foram melhores quando o sêmen não foi centrifugado (27% vs 21%). Para a monta natural, a taxa de concepção por estação de monta foi de 71%.
No experimento de Ferreira (1993) utilizando apenas um reprodutor asinino, o sêmen a fresco diluído foi mantido à temperatura ambiente por um período máximo de uma hora, embora o sêmen diluído e resfriado fosse mantido em geladeira, a uma temperatura de 4-6°C por 24-48 horas, até as inseminações. O sêmen resfriado por 48 horas respondeu por valores inferiores de motilidade progressiva e vigor, em relação ao resfriado por 24 horas, que também diferiu dos valores observados no sêmen a fresco. Os valores obtidos para a motilidade progressiva foram de 70,00%, 56,67% e 49,10%, sendo os valores de vigor de 3,22, 3,00 e 2,68, respectivamente, para o sêmen a fresco diluído ou resfriado por 24 ou 48 horas (p<0,05 entre os tempos de armazenamento). Embora a qualidade do sêmen decrescesse quanto às características físicas ao longo do tempo de armazenamento, a fertilidade não foi influenciada pelos diferentes tempos de estocagem. Assim, o número de IA/ciclo foi de 1,48, 1,27 e 1,38; o número de IA/ciclo positivo de 1,79, 1,58 e 1,82 e as taxas de gestação/ciclo de 82,70%, 80,00% e 75,90% para o sêmen a fresco diluído ou resfriado por 24 ou 48 horas, respectivamente. Considerando-se esses índices como excelentes, aliados aos resultados de Leite (1994), poderia se propor que a quantidade mínima necessária de espermatozóides, por dose
inseminante, estaria entre 200-250 x 106 de células com motilidade progressiva, capazes de responder por uma taxa satisfatória de gestação, na produção de muares.
2.2. Fatores que Podem Influenciar a Fertilidade de Éguas Inseminadas
2.2.1. Efeito do Intervalo Inseminação/Ovulação Os principais fatores determinantes do intervalo ideal entre inseminações são a viabilidade do oócito e do espermatozóide no trato genital da fêmea, além do tempo requerido para a capacitação espermática. Se por um lado as cobrições pré-ovulação dependem da viabilidade espermática, as cobrições pós-ovulação dependem da viabilidade do oócito (Woods et al., 1990; Palhares, 1997).
Segundo Hunter (1990), a partir de 12 horas após a liberação do oócito, ocorre um significativo processo de mudanças que resultam na degeneração do gameta feminino. Diferentemente do que ocorre no macho, que libera milhões de espermatozóides no ejaculado, em diferentes estádios de maturação, na fêmea, o oócito liberado é uma célula mais complexa, apresentando-se como uma esfera de 120µm de diâmetro, composta por uma variedade de organelas citoplasmáticas. O envelhecimento é caracterizado por perda de estabilidade das organelas citoplasmáticas e nucleares, quando o oócito se encontra na tuba uterina, após a ovulação, resultando em dois tipos de alterações: 1) perda dos cromossomos da placa metafisária, em conseqüência da desorganização dos pares de microtúbulos. Neste caso, o óvulo continuaria em sua divisão meiótica, em anáfase e telófase e, mesmo que viesse a ser fecundado, poderia formar um zigoto com alteração de cromossomos, sendo a morte embrionária precoce a alteração mais frequente. 2) Outro problema, advindo do envelhecimento, seria uma falha na liberação do conteúdo dos grânulos corticais no espaço perivitelínico, responsável pelo bloqueio da polispermia. Assim, o óvulo ficaria sujeito a múltiplas fertilizações, perdendo sua capacidade de formar um embrião normal.
A viabilidade do oócito na espécie eqüina, de até 24-30 horas (Woods et al., 1990) é maior, se comparada à de outros mamíferos (8-10 horas),
podendo esta maior longevidade ser conseqüência do estádio de maturação em que o gameta é liberado. Em éguas, os oócitos podem ser liberados ainda imaturos, no estádio de oócito I, ou numa fase intermediária entre os estádios I e II da meiose. Segundo Hunter (1990) essa peculiaridade da espécie parece se dar pela inexistência de um pico incisivo pré-ovulatório de gonadotropinas, ao contrário do que ocorre em bovinos, ovinos e suínos.
Em relação à individualidade do garanhão, deve- se considerar a importância da motilidade progressiva, morfologia espermática, tempo exigido para a capacitação, concentração da dose inseminante e longevidade da célula espermática no sistema genital da fêmea. A frequência de cobrições ou inseminações é um dos aspectos mais importantes do manejo reprodutivo de equinos, e que depende fundamentalmente da individualidade do garanhão e do tipo de sêmen utilizado, segundo Silva Filho et al. (1998).
Na raça Puro Sangue Inglês, devido à proibição da utilização da IA e do alto valor das coberturas, os veterinários são pressionados por um melhor controle reprodutivo para detecção exata do momento da ovulação, visando-se uma única cobrição no intervalo mais próximo da liberação do oócito. Belling (1984) trabalhou com os dados de sete anos, num total de 355 éguas das raças Puro Sangue Inglês e Quarto de Milha, em que as éguas eram cobertas uma vez por ciclo, dentro de duas horas da detecção da ovulação, num intervalo máximo de 24 horas pós-ovulação. Neste trabalho, obteve-se um número de serviços/concepção variando de 1,00 a 1,56, com média de 1,45, que resultaram em taxas de concepção de 74,05%, 16,04%, 5,80% e 4,09% do primeiro ao quarto ciclo, respectivamente.
Segundo Sieme et al. (2003), o uso do hCG é de grande valia no aumento das chances de inseminação no tempo correto, o mais próximo possível da ovulação, devido à possibilidade de sua sincronização. Em seu estudo, para fêmeas inseminadas uma vez por ciclo com sêmen resfriado por 2-4 horas a 5°C em meio INRA82 modificado (à base de leite desnatado), as taxas de gestação foram superiores quando realizadas dentro de 24 horas pré-ovulação (0-12 horas - 53,60%; 12-24 horas - 59,10%), em relação àquelas realizadas dentro de 24-48 horas pré- ovulação (18,20%). Combinados os grupos cujas