A modelagem molecular foi realizada a partir de métodos semi- empíricos, DFT e mecânica molecular.
5.2.13.1 Caracterização do polímero obtido por espectroscopia UV- vis e espectroscopia de infravermelho
Os confôrmeros com o mínimo de energia global do dec (3-HBA) foram submetidos a cálculos quânticos utilizando-se o modelo semi-empírico RM1153 com vistas à uma pré-otimização da estrutura para o cálculo de freqüência de vibração. Estas estruturas foram reotimizadas e os espectros de infravermelho foram simulados, utilizando o funcional híbrido B3LYP com as funções de bases atômicas 6-31G (d) e 6-31G (d, p). O espectro de infravermelho (IR) também foi simulado, para fins de comparação, segundo os modelos semi- empírico RM1 e PM6, com base no MOPAC 2009. Em ambos os casos os
modos de vibração mais intensos foram comparados com os espectros de infravermelho experimentais do poli (3-HBA).
O espectro de absorção da estrutura eletrônica otimizada do dec (3 – HBA), considerando a presença da acetonitrila, implicitamente, como solvente e usando a abordagem do Formalismo da Equação Integral do Modelo Contínuo Polarizado (FEIMCP)154 foi simulado usando M06 (6-311++G(2d, 2p)
e 6-311G (d, p)), considerando-se as 60 menores excitações singlete-singlete, tomando o primeiro estado excitado (root=1) como referência.
O traçado de contorno do espectro foi construído encaixando (fitando) o pico de meia largura e meia altura do UV-vis em 4400 cm-1. As representações
dos espectros eletrônicos singlete-singlete e dos espectros DOS e os orbitais moleculares foram feitos usando o software Gaussian155.
5.2.13.2 Modelagem molecular do polímero
Após a elucidação da estrutura mais provável para o poli (3-HBA) modelos com um ou dois decâmeros, polimerizados a partir do ataque de um cátion radical fenólico sobre o carbono 4 do anel, foram desenhados com a interface gráfica do Maestro e submetidos a análises conformacionais usando o método estocástico de múltiplos mínimos de Monte Carlo156. Todos os ângulos de torção livres foram utilizados como variáveis em 50000 passos de busca com o campo de força OPLS157, devidamente parametrizado no programa Macromodel da Schrodinger158. As estruturas de mínima energia obtidas foram
exportadas para a otimização da estrutura com cálculos DFT, utilizando-se o Funcional M06159 e funções de base 6-31G(d), convenientes para reproduzir interações pi, esperadas para estes oligômeros160. O espectro de infravermelho
obtido para o decâmero certificou que a estrutura realmente corresponde ao mínimo de energia, devido à ausência de frequências negativas, na sequência, foi comparado com o resultado experimental equivalente, como forma de validar o modelo estrutural obtido.
5.2.13.3 Modelagem molecular da proteína de membrana Am1
Após buscas frustradas de modelagem comparativa, a estrutura tridimensional da proteína foi elucidada por modelagem baseada em modelo web server RaptorX161. Esse é um servidor de predição de estruturas de proteínas, empregado para predizer estruturas tridimensionais para sequências de proteínas sem homólogos no "Protein Data Bank" (PDB). Com isso, a partir de uma sequência de entrada, RaptorX prevê as estruturas secundárias e terciárias das proteínas, além das interações com solvente e sítios de ligação.
As cadeias laterais de proteínas pequenas (polipeptídeos) e a minimização de energia da cadeia principal foram realizadas utilizando o campo de força FoldX da versão 3,0b6162. A estabilidade da estrutura protéica
foi analisada por 10000 passos da dinâmica de Monte Carlo, utilizando o campo de força OPLS163. Durante a simulação, a estrutura da proteína Am1
permaneceu na conformação inicialmente otimizada com um pequeno desvio quadrático médio (RMSD= 3,3 Å).
5.2.13.4 Modelagem molecular da 4-AAP e suas interações com a proteína de membrana Am1
As estruturas da 4-AAP neutra e parcialmente protonada foram desenhadas e submetidas a cálculos DFT utilizando-se o funcional B3LYP164 com o conjunto de funções de base gaussianas, 6-311G (2d,p). Cálculos irrestritos equivalentes (UB3LYP/6-311G (2d,p) foram efetuados com os respectivos cátions radicais (espécies oxidadas), alterando-se carga e multiplicidade de spin. Foram observadas as variações de energia, de ordens de ligação, de cargas parciais e densidades de spin dos radicais otimizados.
As interações intermoleculares entre a 4-AAP e o antígeno Am1 foram previstas a partir da técnica de atracamento molecular,165 geralmente utilizada
para prever as interações de fármacos em sítios ativos, com mecânica molecular.166 Em nosso procedimento, uma caixa tridimensional envolvendo
toda a proteína foi considerada para o espaço de busca pelas interações mais favoráveis com o ligante. Foi empregado o método de grid com tamanho de
0,375 Å, onde em cada ponto do grid é calculado a interação da proteína. Com os mapas de interação, realizou-se 100 simulações de atracamento molecular empregando o método de Algoritmo Genético Lamarckiano167 onde a população de cada simulação era formada por 200 complexos. O algoritmo genético introduz variações aleatórias em cada uma das 100 conformações do complexo proteína-ligante (mutações nos seres vivos) e associa a cada conformação a sua energia de complexação (fitness ou adaptação). A probabilidade da conformação se reproduzir e estar presente na próxima geração é proporcional à sua energia de complexação. Um procedimento de minimização de energia de cada conformação foi realizado entre cada geração, correspondendo à parte lamarckiana do processo. As conformações finais foram agrupadas pelo método de clustering, onde o RMSD entre as conformações do mesmo cluster foram de 2 Å.
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inicialmente, serão apresentados os resultados experimentais sobre a eletropolimerização do 3-HBA e as principais propriedades eletroquímicas do filme eletrogerado [poli (3-HBA)]. Com base nesses resultados experimentais, foram propostos os estudos teóricos do 3-HBA e do poli (3-HBA) cujos resultados e o mecanismo de eletropolimerização do filme serão apresentados na sequência.
Vale ressaltar que esses estudos são imprescindíveis para o desenvolvimento da palataforma funcionalizada (superfície transdutora) para a incorporação de pepetídeos (Am1) que serão utilizados no desenvolvimento de um imunossensor para o diagnóstico da A. marginale. Posteriormente, estão os resultados referentes à detecção do alvo complementar à biomolécula imobilizada (Am1) e a caracterização do imunossensor desenvolvido.
6.1 ESTUDO DA FORMAÇÃO E DAS PROPRIEDADES DO POLI (3-HBA) EM