Assim, numa fase inicial foi necessário proceder à mimetização da ação biológica da PDI em relação à insulina, tendo-se recorrido, para tal, à redução das pontes dissulfito desta hormona por intermédio de uma reação química. Deste modo, para a realização desta primeira etapa foi imprescindível a utilização de diversos compostos, designadamenteμ EDTA, ureia, insulina bovina, β-mercaptoetanol e atmosfera de árgon.
Inerente à utilização destes compostos, torna-se essencial proceder à explicação da sua escolha. Assim, o EDTA, tal como referi anteriormente, é um agente quelante que forma complexos estáveis com vários iões, em especial os metais de transição. Por isso a sua utilização nesta reação química pode ser justificada pelo facto de impossibilitar a ligação de certos iões às cadeias de insulina, o que possivelmente originaria a formação de precipitados destas duas cadeias.
O segundo composto a ser utilizado foi a ureia, visto ser um agente desnaturante. Desta forma, com a sua adição à mistura reacional, promoveu-se a desnaturação da forma nativa da insulina com quebra das ligações hidrofóbicas inter e intracadeias.
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 A bs or vânc ia Tempo (minutos)
De seguida, adicionou-se a insulina ao recipiente em que iria ocorrer a reação química, que tal como referi anteriormente teve o seu uso justificado pelo facto de ser a proteína em estudo no presente projeto de investigação devido à sua possível relevância para a libertação da HISS e dada a possível importância da cadeia A ou B da insulina a nível biológico.
Posteriormente, recorreu-se ao uso de β-mercaptoetanol (agente redutor) com vista à redução das pontes dissulfito da insulina e respetiva produção de cadeia A e B isoladas.
Para além destes constituintes, utilizou-se ainda, uma atmosfera de árgon de modo a evitar a oxidação das cadeias A e B originadas após a reação do β-mercaptoetanol com a insulina.
Finalizada a reação química que impulsionou a presença de cadeia A e B da insulina isoladas, e com o objetivo de separar estas duas cadeias para dois recipientes distintos, recorreu-se ao uso da técnica de HPLC para a separação das mesmas.
Neste âmbito, é de ter em conta que o uso desta técnica apenas foi possível pelo facto destas duas cadeias apresentarem pesos moleculares distintos (e consequentemente tempos de retenção diferentes), e dado que todos outros constituintes da mistura reacional apresentam pesos moleculares bastante inferiores quando comparados com cada uma das cadeias isoladas.
Posto isto, visto que a cadeia A da insulina apresenta um peso molecular de aproximadamente 2.5 KDa e a cadeia B um peso molecular de 3.3 KDa, ocorreu o aparecimento de um primeiro pico no cromatograma, correspondente à cadeia B e um a seguir, e bastante próximo do primeiro, relacionado com a presença de cadeia A (Gráfico 6).
Cadeia B
Cadeia A
Gráfico 6 – Resultado obtido após injeção de 20 l da reação química ocorrida para a separação da cadeia
Subjacente ao que acabei de referir, com o aparecimento do primeiro pico relacionado com a cadeia B da insulina, tornou-se possível a sua extração, visto ser o primeiro componente da mistura reacional a sair pela coluna. De seguida, e seguindo a mesma lógica, recolheu-se a cadeia A.
2.1.2. Purificação da cadeia A e B da insulina pela técnica de HPLC
Cessada a extração destas duas cadeias, foi então possível proceder à produção dos novos derivados de insulina por nitrosilação de ambas as cadeias. Assim inerente a esta terceira etapa, tornou-se necessário recorrer ao uso de uma panóplia de reagentes, entre eles: o EDTA, bicarbonato de sódio, GSH, nitrito de sódio e albumina.
Deste modo, o facto da possível presença de metais de transição em solução poder modificar, de certo modo, reações que envolvam óxido nítrico, justifica a utilização do EDTA nesta fase experimental.
No que toca ao bicarbonato de sódio, este foi utilizado com o intuito de levar à formação de produtos de potencial terapêutico com características o mais fisiológicas possível, dado que as amostras de cadeia A e B da insulina estavam inicialmente dissolvidas em ácido fórmico a 20%.
Outro constituinte a merecer destaque é o GSH, que apenas foi utilizado com o objetivo de reduzir as cadeias que possivelmente pudessem ter oxidado durante o manuseamento do HPLC.
O nitrito de sódio, por sua vez, foi utilizado de forma a servir como dador de NO- à cadeia A ou B de insulina reduzidas, que posteriormente à reação das mesmas com o óxido nítrico originariam cadeias nitrosiladas.
Por fim, e tal como referido no início deste capítulo, no âmbito de uma aplicabilidade terapêutica destes novos derivados de insulina nitrosilados e da tentativa de comprovar que a HISS20 não circula na corrente sanguínea per se, tornou-se necessário a adição de uma proteína transportadora à mistura reacional, visto que a ação de determinadas proteínas está dependente da sua entrega ao respetivo local de ação. Assim, subjacente ao facto da albumina ser uma proteína transportadora multifuncional procedeu-se à sua escolha como meio de transporte dos produtos originados após nitrosilação.
Posteriormente à produção destes compostos com potencial terapêutico ao nível da resistência à insulina, efetuou-se o envio dos mesmos para o Departamento de
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De acordo com o projeto de investigação em causa, propôs-se que a HISS trata-se de um dos derivados de insulina nitrosilados produzidos em laboratório.
Fisiologia da FCM-UNL, para determinação do potencial terapêutico dos compostos produzidos in vitro, através da administração dos mesmos em miotubos de ratos Wistar e a ratos Wistar.
2.2.ADMINISTRAÇÃO DOS NITROSILADOS DE CADEIA A E B DA INSULINA A