Expandindo os testes de resolução cinética mediada por BVMOs, compostos quirais contendo selênio foram empregados como substratos. Estes compostos foram escolhidos por conter diferentes grupos ligados diretamente ao átomo de selênio (fenila e benzila, respectivamente).
109 Da Costa, C. E.; Comasseto, J. V.; Crusius, I. H. S.; Andrade, L. H.; Porto, A. L. M. J. Molec. Catal. B.:
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Primeiramente realizaram-se reações utilizando os compostos 44 e 48 (sem substituinte ligado ao anel aromático do carbono quiral) mediadas por PAMO, utilizando a mesma metodologia detalhada anteriormente (4 μM de enzima) (Tabela 9, entradas 1 e 7). Porém, em até 24 h de reação o material de partida foi recuperado intacto. Então com base em experiências prévias do nosso grupo,83c onde uma quantidade maior de BVMOs foi utilizada para a oxidação do átomo de selênio, resolvemos aumentar a quantidade de enzima utilizada. Aumentando a quantidade de enzima na reação (8 μM), foi observada a oxidação do substrato com grande enantiosseletividade (Tabela 9, entrada 2). Após os primeiros testes, foi aumentada também a quantidade de fosfito de sódio (substrato de sacrifício), este aumento levou a um acréscimo na enantiosseletividade da reação (Tabela 9, entrada 3).
Sabendo que peróxido de hidrogênio pode ser produzido por BVMOs no meio reacional e que esta produção pode levar a diminuição na enantiosseletividade do processo, testou-se também a adição de catalase na reação. A catalase é uma enzima que degrada o peróxido de hidrogênio formado em oxigênio e água. No entanto, esta adição levou a muitos sub-produtos mesmo na ausência de PAMO no meio reacional. Isto pode ser resultado da baixa pureza da catalase comercial empregada, que pode conter pequenas quantidades de outras enzimas oxidorredutases.
Também foram testadas outras BVMOs (PAMO M446G, CHMO e HAPMO). Quando PAMO M446G foi empregada como biocatalisador, boa conversão, porém baixa seletividade foi observada (Tabela 9, entradas 4 e 10). Infelizmente, quando
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CHMO ou HAPMO foram utilizadas não foi observada reação e o material de partida foi isolado ao final de 24 h (Tabela 9, entradas 5, 6, 11 e 12).
Tabela 9 – Resolução cinética enzimática de selenetos quirais (44 e 48) mediada por BVMOs.a, 110
SeR SeR RSeOH H2O RSe(O)OH BVMO NADPH NADP+ Fosfito Fosfato PTDH O2 H2O (S)- 44 ou 48 44, R = Ph 48, R = Bn Estireno
Entrada Substrato Enzima/Conc. (μM) Fosfito (mM) Tempo(h) Conv. (%)b e.e (S)-44/48 (%)c
1 44 PAMO (4) 20 24 (-)d (-)e 2 44 PAMO (8) 20 5 52 83,5 3 44 PAMO (8) 50 5 49 97,7 4 44 M446G (8) 50 5 45 10 5 44 HAPMO (8) 50 24 (-)d (-)e 6 44 CHMO (8) 50 24 (-)b (-)e 7 48 PAMO (4) 20 24 (-)d (-)e 8 48 PAMO (8) 20 5 53 (-)e 9 48 PAMO (8) 50 5 56 14 10 48 M446G (8) 50 5 51 9,7 11 48 HAPMO (8) 50 24 (-)d (-)e 12 48 CHMO (8) 50 24 (-)d (-)e a
Condição Reacional: Solução (10 mmol.L-1), DMSO (1%), tampão tris-HCl pH 7,5 (440 µL), fosfito (20 ou 50 µmol.L-1), NADPH (0,2 mmol.L-1), PTDH (1 µmol.L-1), enzima (4 ou 8 µmol.L-1). 30°C, 200 rpm, 5-24 h. b Conversão calculada através de curva de calibração por CLAE. c Excesso enantiomérico medido por CLAE equipado com fase estacionária quiral. d nenhuma reação observada. e nenhum excesso enantiomérico observado.
110 Para comparação: o substrato 44 (0,1 mmol) é oxidado completamente em metanol (0,5 mL) e NaIO 4 (0,2 mmol) ou em THF (0,5 mL) e m-CPBA (0,2 mmol) ambos em 3h a temperatura ambiente. Porém, no mesmo tempo reacional e temperatura não ocorre oxidação completa utilizando H2O2 30% (3 mmol) e solução 2M de NaOH (1 mmol), mas nas mesmas condições na presença de n-hexano ocorre conversão quase total do material de partida.
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No decorrer da reação, quando esta ocorre, observou-se a oxidação do (R)- seleneto levando a β-eliminação resultando em PhSeOH e estireno (detectado por CLAE), deixando o (S)-seleneto intacto (ver item 4.5.5 para determinação da configuração absoluta).
Com a melhor condição em mãos, foram realizadas reações de oxidação dos demais compostos quirais contendo selênio (45, 46, 49 e 50), utilizando PAMO, a melhor enzima nos testes prévios, como biocatalisador (Tabela 10).
Tabela 10 – Resolução cinética de selenetos quirais (45, 46, 49 e 50).
SeR SeR RSeOH H2O RSe(O)OH BVMO NADPH NADP+ Fosfito Fosfato PTDH O2 H2O (S)- 45, 46, 49 ou 50 45, R = Ph, R1 = Me 46, R = Ph, R1 = F 49, R = Bn, R1 = Me 50, R = Bn, R1 = F R1 R1 R1
Entrada Substrato Tempo (h) Conv. (%)a e.e. (S)-45, 46, 49 ou 50(%)b
1 45 8 51 8,6
2 46 8 54 (-)c
3 49 5 49 (-)c
4 50 5 47 49,15
a Conversão calculada através de curva de calibração por CLAE. b Excesso enantiomérico medido por CLAE equipado com fase estacionária quiral. c nenhum excesso enantiomérico observado.
A enzima PAMO foi capaz de oxidar os substratos (45, 46, 49 e 50), porém esta transformação ocorreu com baixa enantiosseletividade (Tabela 10). Novamente a
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presença de substituintes no anel aromático ligado ao carbono quiral parece afetar negativamente o desempenho da enzima BVMO utilizada (neste caso PAMO).
Dando continuidade aos estudos de oxidações biocatalisadas de substratos quirais contendo selênio, foram realizadas ainda reações utilizando fungos contendo oxidorredutases. Estas reações foram baseadas em experiência prévia de oxidação do átomo de selênio utilizando fungos contendo oxidorredutases.109 Para tal foram
testados os fungos Aspergillus terreus URM 3571 e CCT 3320 para oxidação do substrato 44, que foi o melhor substrato contendo selênio. Foram realizadas reações utilizando tampão tris-HCl (pH 7,5), substrato e o fungo, incubadas a 32 °C e 160 rpm em tempos reacionais de 1, 3 ou 5 dias. Todas as reações foram acompanhadas de reação controle sem a presença de fungo no meio.
Mesmo em até 5 dias o material de partida (44) permaneceu racêmico e observou-se baixa concentração de estireno. Portanto, não houve uma oxidação significativa do átomo de selênio. De certa forma, os resultados obtidos vão de encontro com aqueles previamente descritos. Em tal experimento observou-se que quando havia certo impedimento estérico ao redor do átomo de selênio, a eficiente oxidação era demorada (em torno de 10 dias) ou não ocorria. Como o substrato escolhido (44) tem duas fenilas próximas ao átomo de selênio a ser oxidado, este volume pode estar dificultando a oxidação mediada por fungo.
Finalizando os testes de oxidação do átomo de selênio mediada por enzimas, foram realizadas reações utilizando lipase (CAL-B) na presença de oxidante (2 ou 3
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equivalentes em relação ao substrato). Estas reações foram idealizadas com base na dificuldade encontrada para a oxidação do selênio e, idealizando uma possível ligação do oxidante à CAL-B o que levaria a uma oxidação enantiosseletiva.56 Portanto, a CAL- B funcionaria como um auxiliar quiral nestas reações. As reações foram agitadas por 3 a 15 h, a 0 °C ou a temperatura ambiente, em solvente orgânico e foram acompanhadas por reação controle na ausência de enzima (Tabela 11).
Tabela 11 – Reações de resolução cinética enzimática de 44 mediada por CAL-B.a
PhSeOH H2O PhSe(O)OH
SePh CAL-B SePh
Oxidante Solvente
44 (S) - 44 Estireno
Entrada Oxidante/ Qtde
(equiv.) Solvente Temperatura (0C) Tempo (h) Conv. (%)b e.e (S)-44 (%)c 1 H2O2/ 3 Hexano 0 2 90 (-)e
2 H2O2 /2 Hexano 25 0,5 100 (-)e
3 NaIO4/3 Hexano 0 2 (-)d (-)e
4 NaIO4/3 Hexano/ MeOH 9:1 25 2 5 7
5 NaIO4/3 Hexano/ MeOH 1:1 25 2 3 (-)e
6 NaIO4/3 Hexano/ AcOEt 9:1 25 2 (-)d (-)e
7 NaIO4/3 Hexano/ MeOH 9:1 25 15 52 7
8 m-CPBA/ 3 Hexano 25 2 46 45 9 m-CPBA/ 3 Hexano/ MeOH 9:1 25 2 100 (-)e 10 m-CPBA/ 3 Hexano/ AcOEt 9:1 25 2 90 5 11 m-CPBA/ 3 Tolueno 25 2 100 (-)e
a Condição Reacional: Substrato (0,25 mmol.L-1), solvente (1 mL), CAL-B (20 mg), Oxidante 2 ou 3 equiv.), 0 ou 25 0C, 3-15 h. b Conversão calculada através de curva de calibração por CLAE. c Excesso enantiomérico medido por CLAE equipado com fase estacionária quiral. d Nenhuma reação observada. e nenhum excesso enantiomérico observado.e Reações controle: seleneto 44 racêmico.
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Na maioria dos casos não houve enantiosseletividade no processo (Tabela 11, entradas 1, 2, 5, 9, 11) ou não houve reação (Tabela 11, entradas 3 e 6). Como podemos notar, o melhor sistema utilizado foi m-CPBA em n-hexano a temperatura ambiente (Tabela 11, entrada 8). Porém, este resultado foi inferior ao obtido quando o biocatalisador utilizado foi PAMO.