1.1 – Soja: A Estrela da Lavoura no Brasil do Século XXI
A soja [Glycine max (L.) Merril] pertence ao reino Plantae, divisão Magnoliophyta, classe Magnoliopsida, ordem Fabales, família Fabaceae, sub- família Faboideae, gênero Glycine e espécie Glycine max. Essa espécie teve origem na Ásia a mais de 5000 anos. Sua evolução começou com o aparecimento de plantas oriundas de cruzamentos naturais, entre duas espécies de soja selvagem, que foram domesticadas e melhoradas por cientistas da antiga China. Sua importância na dieta alimentar da antiga civilização chinesa era tal, que a soja, juntamente com o trigo, o arroz, o centeio e o milho, foi considerada um grão sagrado, com direito a cerimoniais ritualísticos na época da semeadura e da colheita. Apesar disso, foi somente na segunda década do século XX que o Ocidente passou a não mais ignorar o seu cultivo e passou a comercializar este grão (CNPSo, EMBRAPA, 1998) (FIGURA 1).
A partir de 1941, a área cultivada de grãos passou a crescer exponencialmente em todo o mundo, sendo que no Brasil foi somente a partir de 1960 que a soja se estabeleceu como cultura economicamente importante para este país. Em 1970, essa leguminosa passou a ser considerada a principal cultura do agronegócio brasileiro. Em 2003, o Brasil figurou como o segundo produtor mundial, responsável por 52 das 194 milhões de toneladas produzidas em nível global ou 26,8% da safra mundial, sendo considerada a estrela da lavoura no Brasil do século XXI, diferentemente do observado na época da colonização em que alguns cultivos, como a cana-de-açúcar, o cacau e o café, marcaram a história do País (Revista Isto É, n 1796, 10 de março/2004) (FIGURAS 2 e 3). Em 2005, o Brasil ainda figurou como o segundo produtor mundial, apesar de uma queda de 20% na produção, ocasionada por estiagens ou excessos de chuva e doenças provocadas por patógenos (EMBRAPA, 2004; USDA, 2005).
FIGURA 2 – Evolução das áreas das principais culturas do Brasil. Fonte: EMBRAPA, 2004.
FIGURA 3 – Histórico das áreas destinadas ao plantio da soja. Fonte: USDA, 2005.
O crescimento da produção de soja sempre esteve vinculado aos avanços científicos e à disponibilidade de tecnologias do setor produtivo. Até 1970, a preocupação maior dos programas de pesquisa de soja brasileiros era com a produtividade. Foi somente a partir dos anos 80 que a resistência a doenças, como a pústula bacteriana, fogo selvagem e a mancha olho-de-rã, passou a se constituir em característica necessária para a recomendação de novas cultivares. Posteriormente, problemas fitossanitários maiores surgiram, como o cancro da haste, juntamente com as doenças provocadas por nematóides, ampliando a lista de exigências para a recomendação de novas cultivares (EMBRAPA, 2004).
1.2 – Soja: Uma Fonte de Nutrientes e de Proteínas Bioativas
A razão para a grande importância nutricional e econômica da soja reside, principalmente, na composição de suas sementes, sendo considerada a mais importante fonte de nutrientes da atualidade, fornecendo, aproximadamente, 65% e 25% da proteína e óleo comestíveis, respectivamente, no mundo (GOLBITZ, 2003). Em geral, os grãos possuem 20% (peso seco) de lipídios, que são de grande importância no setor industrial na produção de óleos, tintas, resinas, solventes e biodiesel (THELEN e OHLROGGE, 2002). O seu alto teor protéico, em torno de 40%, tornou esta leguminosa uma fonte alternativa de proteínas, principalmente para as populações menos favorecidas, por serem de baixo custo. Além disso, a soja é capaz de fornecer a maioria dos aminoácidos essenciais requeridos na alimentação humana, sendo muito utilizada em associação com outras proteínas de origem vegetal, como aquelas provenientes dos cereais. Todavia, é oportuno dizer que o valor nutricional da soja é abaixo do esperado, considerando seu conteúdo protéico e sua composição de aminoácidos. A razão para isso é que essa leguminosa possui uma série de proteínas com propriedades tóxicas e/ou antinutricionais que depreciam a sua qualidade
nutritiva (VASCONCELOS et al., 1994; BECKER-RITT et al., 2004; SIEBRA, 1998, 2004). Os inibidores de tripsina e a lectina (SBA) são considerados as principais proteínas da soja, responsáveis pelo seu baixo valor nutricional (LIENER, 1994; CLARKE e WISEMAN, 2000). Recentemente, foi sugerido que outras proteínas, de ocorrência natural, tais como a soyatoxina (SYTX) e urease, podem também contribuir para os efeitos deletérios oriundos do consumo de soja in natura (VASCONCELOS et al., 2001).
Os teores de proteínas tóxicas e/ou antinutricionais variam não somente entre as espécies vegetais, como também entre os genótipos de uma mesma espécie. A soja, por exemplo, apresenta uma grande variabilidade nos conteúdos de inibidores de tripsina, lectina, toxina e urease entre seus genótipos (VASCONCELOS et al., 1997). Nos últimos anos, a biotecnologia tem sido uma ferramenta bastante utilizada por pesquisadores interessados no aumento do valor nutricional das sementes de soja. As técnicas de melhoramento têm permitido a obtenção de genótipos de soja livres de fatores antinutricionais e/ou tóxicos, como os citados anteriormente (BURTON 1997; CLARKE e WISEMAN, 2000).
Os benefícios nutricionais obtidos pela diminuição de seus conteúdos nas sementes podem trazer, como conseqüência, perdas econômicas relacionadas com a susceptibilidade das sementes ao ataque de pragas e doenças, no campo ou sob armazenamento, tendo em vista que a maioria dos fatores antinutricionais e/ou tóxicos está envolvido com a proteção da planta contra o ataque de agentes agressores (ARMOUR et al., 1998). Técnicas objetivando o aumento da proteção das sementes contra ataque de pragas e patógenos nas lavouras, através da expressão de genes para estas proteínas, poderiam ocasionar drásticas conseqüências ambientais. Down e colaboradores (1999) referiram-se ao efeito do inibidor de Kunitz presente na soja que, quando ingerido por larvas de Leucaena olearacea, foi detectado na hemolinfa desta lagarta, podendo assim ser absorvido pelas vespas usadas no controle biológico de pragas e vir a prejudicá-las, interferindo no resultado deste tipo de controle.
Dentro do contexto, é importante um estudo sistemático relacionando resistência e valor nutricional, a fim de averiguar se os componentes relacionados com a resistência vegetal, no nível em que são detectados, não interferem na qualidade nutricional do genótipo. Essa avaliação é de grande valia não apenas na seleção de genótipos, mas, similarmente, em genótipos transgênicos, de modo a compará-los com aqueles não transformados, verificando se as alterações promovidas não afetaram suas qualidades nutricionais.
1.3 – Toxinas Vegetais
Ao longo da evolução, as plantas desenvolveram sofisticados mecanismos de defesa, que expressam principalmente em suas sementes, como um arsenal de substâncias constitutivas e/ou induzidas, responsáveis pela resistência do vegetal à infecção por vírus, bactérias, fungos, nematóides, e vários outros organismos, como insetos fitófagos (CARLINI e GROSSI-DE-SÁ, 2002; VAN DEN BERGH et al., 2002; VASCONCELOS e OLIVEIRA, 2004). Essas substâncias, que causam efeitos biológicos adversos a vários organismos que co-habitam com as plantas o mesmo ecossistema, são de natureza química bastante diversificada, muitas delas sendo de origem protéica. Entre os componentes protéicos ativos estão as toxinas vegetais.
Um grupo de toxinas vegetais ainda pouco estudado é representado pela canatoxina, uma proteína tóxica obtida da semente do feijão de porco (Canavalia ensiformis; CARLINI e GUIMARÃES, 1981). A canatoxina (CNTX) injetada por via ip produz convulsão e morte de ratos e camundongos (DL50 =
2,0 mg/Kg de peso corpóreo), mas é inócua nesses animais, se for administrada por via oral (CARLINI e GUIMARÃES, 1991). Estruturalmente, a CNTX é um dímero de cadeias polipeptídicas de ~95 kDa, ligadas não covalentemente, sendo uma isoforma da urease presente na mesma semente,
com cerca de 85% identidade, mas apenas 30-40% da sua atividade enzimática sobre uréia (FOLLMER et al., 2001).
O mecanismo de ação da CNTX envolve um potente efeito secretagogo em vários tipos de células de mamíferos, mediado por eicosanóides via lipoxigenases, bem como alterações dos níveis intracelulares de cálcio (CARLINI e GUIMARÃES, 1991). Outros estudos indicaram que a CNTX tem ação fungicida (OLIVEIRA et al., 1999) e apresenta potente efeito inseticida contra alguns tipos de insetos. Nesse caso, a proteína ingerida pelo inseto sofre proteólise liberando um peptídeo entomotóxico de ~10 kDa no trato digestório das espécies suscetíveis (insetos que apresentam digestão ácida baseada em catepsinas). A proteína, por outro lado, mostrou-se atóxica em insetos com digestão baseada em enzimas tipo tripsina (CARLINI et al., 1997). O espectro de ação inseticida da canatoxina é bastante interessante em termos biotecnológicos, pois atinge insetos-praga que escapam do efeito das delta- endotoxinas do Bacillus thuringiensis. Essas proteínas também são pró-toxinas que, após proteólise, liberam um fragmento ativo no trato digestório alcalino de insetos que possuem enzimas tipo tripsina como as principais proteinases digestivas, como lepidópteros, alguns coleópteros e dípteros (HUANG et al., 1999).
É importante observar que, além da atividade inseticida, outros efeitos biológicos relatados para a CNTX e urease são independentes de sua atividade enzimática sobre uréia, já que persistem nas proteínas tratadas com inibidores específicos de urease (FOLLMER et al., 2001, 2004). Recentemente, um “gene truncado” codificando um peptídeo entomotóxico da CNTX foi introduzido em Escherichia coli. O produto desse gene, um peptídeo recombinante de 10 kDa, batizado como jaburetox-2Ec, apresenta potente atividade entomotóxica (0,01% m/m) para o hemíptera Dysdercus peruvianus. O espectro de ação inseticida do jaburetox 2Ec é mais amplo do que o da CNTX intacta, afetando também insetos com digestão baseada em tripsinas, como a barata Blatella germanica. Por outro lado, em doses 5 vezes a DL50 da CNTX, o peptídeo
recombinante mostrou-se inócuo quando administrado por via ip ou por via intragástrica (ig) em camundongos ou ratos neonatos, ressaltando a
potencialidade de uso do peptídeo jaburetox-2Ec como um bioinseticida (MULINARI, 2004).
Proteínas tóxicas e imunorreativas contra anticorpos anti-CNTX foram detectadas em várias espécies de leguminosas comestíveis (CARLINI et al., 1988). Da soja, foram purificadas e caracterizadas duas toxinas protéicas, a soyatoxina (SYTX) e a toxina da soja (SBTX).
A SYTX (DL50 7-8 mg/Kg de peso corpóreo) é uma proteína ácida de
cadeia única, possuindo Mr em torno de 21 kDa (VASCONCELOS et al., 1994). Essa toxina foi capaz de induzir efeitos tóxicos bastante severos sobre o pâncreas de ratos, quando presente em dieta experimental (VASCONCELOS et al., 2001).
A SBTX (DL50 6,0 mg/Kg de peso corpóreo) foi purificada através de
cromatografias de troca iônica e filtração em gel. PAGE-SDS revelou que a SBTX trata-se de uma proteína dimérica de massa molecular de 44,0 kDa, composta por duas subunidades distintas, uma de 27,0 kDa e outra de 17,0 kDa. Eletroforese bidimensional de SBTX revelou a presença de duas subunidades de massas moleculares aparentes de 29,0 e 17,0 kDa, com valores de pontos isoelétricos correspondentes a 5,3 e 8,0, respectivamente. Essa toxina foi capaz de inibir o crescimento do fungo Cercospora sojina e de reduzir os percentuais de sobrevivência e peso médio de D. peruvianus. Uma fração rica em SBTX também exerceu efeitos tóxicos sobre a emergência, ganho de peso e tempo de desenvolvimento de Callosobruchus maculatus. Essa toxina parece ter uma distribuição generalizada no vegetal, tendo sido detectada em cotilédones, caules, raízes e folhas de plântulas de BR-10. Além disso, foi verificado que durante a germinação das sementes, ocorreu uma redução nos teores de SBTX em cotilédones, caules e raízes e um aumento nas folhas. Os resultados de ação contra fungos e insetos, juntamente com aqueles de sua localização e comportamento temporal levou o autor a sugerir que a SBTX deveria fazer parte do mecanismo de defesa da soja contra agressores (SIEBRA, 2004).
Algumas lectinas também podem ser letais quando ingeridas em altas doses (SANTORO et al., 1997; SHARON, 1998). A lectina de Phaseolus
acutifolius, quando injetada no peritônio de camundongos, causou intensa inflamação no abdome acompanhado por crescimento hiperplásico do intestino e zonas hemorrágicas nos pulmões. Dose de 1,2 mg de lectina por Kg de animal foi capaz de causar a morte em 83,3% dos animais (REYNOSO-CAMACHO et al., 2003). A lectina de Gracilaria ornata mostrou-se tóxica para camundongos quando administrada pela via intravenosa (iv). Os efeitos parecem ter sido devido à ação da lectina sobre o sistema nervoso, uma vez que os animais apresentaram ataxia locomotora, dispnéia e convulsões tônico-clônicas que precederam a morte (LEITE et al., 2005). A lectina de Ipomoea asarifolia (LTS) é outro exemplo de proteína neurotóxica, capaz de causar convulsão e morte em camundongos quando injetada por via ip. Acredita-se que esta toxina seja, pelo menos em parte, responsável pelos efeitos tóxicos apresentados pela salsa, os quais têm sido responsáveis por grandes perdas nos rebanhos de caprinos, ovinos e bovinos. Quando administrada pela via oral a camundongos lactantes a LTS parece ter sido veiculada através do leite, ocasionando redução no ganho de peso dos camundongos lactentes. Além disso, uma fração rica em LTS foi capaz de reduzir a emergência e retardar o desenvolvimento de C. maculatus, evidenciando o potencial biotecnológico que esta proteína representa (SANTOS, 2001).
1.4 – Justificativa e Hipótese do Capítulo 1
Embora o estudo da SYTX tenha se iniciado bem antes daquele realizado com a SBTX, há muitas questões em aberto quando considerada essa toxina. Todavia, é sabido que a elucidação da estrutura molecular dessa proteína “canatoxina-like” de baixa massa molecular e a clonagem de seu gene darão subsídio para o entendimento das relações estrutura X atividade biológica dessa família de proteínas potencialmente envolvidas com os mecanismos de defesa em plantas. Nesse contexto específico, a identificação, purificação, caracterização, conhecimento de como essa toxina age a nível celular e o
estabelecimento de seu mecanismo de ação são de fundamental importância para o uso dessa proteína.
Por fim, embora as etapas de purificação da SYTX tenham sido previamente estabelecidas por Vasconcelos et al. (1994), foi verificado que com a metodologia anteriormente empregada outras proteínas co-purificavam, particularmente o inibidor de tripsina tipo Kunitz (KSTI). Além disso, no procedimento utilizado, a SYTX apresentou baixo rendimento e perda da atividade tóxica. Assim sendo, foi que surgiu o seguinte questionamento:
“Uma modificação na metodologia usada para purificação da SYTX poderia resultar no aprimoramento de seu isolamento, de modo a possibilitar uma melhor caracterização físico-química, bioquímica e estrutural dessa toxina e, ainda, o seu acúmulo na forma ativa, a fim de permitir uma avaliação de seu mecanismo de ação e de algumas atividades biológicas?”
2 – OBJETIVOS
Purificação, caracterização bioquímica e físico-química da soyatoxina (SYTX), uma toxina de sementes de soja [Glycine max (L.) Merril].
3 – MATERIAIS
3.1 – Material Vegetal
Sementes quiescentes de soja [(Glycine max (L.) Merril] genótipos BR- 10, Teresina-RC (TRC), Teresina-RCH (TRCH) e Cariri-RCH (CRCH) foram fornecidas pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Teresina, Piauí. Os genótipos BR-10 e TRC apresentam resistência ao fungo fitopatogênico Cercospora sojina, causador da mancha de olho-de-rã, diferentemente do genótipo TRCH que é suscetível a essa doença. Já o genótipo CRCH é resistente ao fungo Diaporthe phaseolorum f. sp. Meridionalis, causador do cancro da haste.
3.2 – Animais de Experimentação
Camundongos
Camundongos Swiss (Mus musculus), 20 a 25 g, foram obtidos de colônias do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará (UFC).
3.3 – Reagentes Químicos
Ditiotreitol, acrilamida, N,N’-metileno bisacrilamida, albumina sérica bovina, “Coomassie Brilliant Blue” G e R, inibidor de tripsina de soja tipo Kunitz (tipo I-S), tripsina, glucuronidase, N,N,N’,N’-tetrametiletanolamina, N-acetil-D-
glucosamina, quitina, calcoflúor, marcadores de massa molecular e membranas de PVDF (difluoreto de polivinilideno) foram obtidos da Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA.
-mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio foram obtidos da Merck, Darmstadt, Alemanha.
DEAE-celulose foi obtida da Wattman.
Sepharose-4B ativada com brometo de cianogênio foi adquirida da Pharmacia, Uppsala, Suécia.
Os demais reagentes utilizados foram de grau analítico e obtidos comercialmente.
4 – MÉTODOS
4.1 – Preparação da Farinha dos Genótipos BR-10, TRC,TRCH e CRCH
4.1.1 – Obtenção da Farinha
Para obtenção da farinha fina, sementes quiescentes dos quatro genótipos de soja (BR-10, TRC, TRCH e CRCH) foram, primeiramente, trituradas em liquidificador e, em seguida, em moinho elétrico para café. As farinhas foram acondicionadas em frascos hermeticamente fechados e conservadas a 4 C.
4.1.2 – Delipidação da Farinha
Amostras das farinhas dos diferentes genótipos foram delipidadas com éter de petróleo, na proporção de 1:10 (m/v), sob exaustão de capela à temperatura ambiente, até a completa remoção dos lipídios. As farinhas delipidadas foram deixadas sobre papel de filtro, à temperatura ambiente, até a evaporação total do solvente. Uma vez delipidadas, as farinhas foram acondicionadas em frascos hermeticamente fechados e conservadas a 4 C.
4.2 – Determinação de Proteína
Para determinação do teor de proteínas foi utilizada a metodologia descrita por Bradford (1976). A 100 L de amostra, em diferentes
concentrações, foram adicionados 2,5 mL do reagente de Bradford. A mistura foi agitada e, após 10 minutos em repouso, foram feitas leituras das absorbâncias a 595 nm (espectrofotômetro tipo Novapesc II, Pharmacia). A concentração protéica foi estimada através de uma curva padrão, obtida a partir de concentrações conhecidas de BSA.
4.3 – Determinação da Atividade Tóxica
Para avaliação da toxicidade pelas vias ip e intravenosa iv foram usados camundongos Swiss, pesando entre 20-25 g, alimentados ad libitum com dieta peletizada comercial. Diferentes teores de proteína foram testados, de modo a encontrar a dose máxima não letal, a dose mínima capaz de causar 100% de letalidade e doses intermediárias envolvendo percentuais de morte no intervalo de 0-100%. Para toxicidade via ip, foram considerados válidos apenas os resultados observados no período de 24 h, enquanto que aquela avaliada por via iv até 1 h após a administração. A toxicidade foi expressa como DL50, sendo
uma unidade considerada como a quantidade de proteína (mg de proteína/Kg de peso corpóreo) necessária para produzir convulsões e morte em 50% dos animais testados (VASCONCELOS et al., 1994).
4.4 – Purificação da Soyatoxina (SYTX) de Sementes de Soja, Genótipo BR-10
Vasconcelos e colaboradores (1994) mostraram que a SYTX, isolada de sementes de soja comercial, era termolábil, de modo que todas as etapas de purificação, com exceção da cromatografia de filtração em gel, foram realizadas a 4 ºC. Nesse mesmo trabalho, os autores ressaltaram que a adição do agente redutor ditiotreitol (DTT), 0,005 M, conferia estabilidade à toxina, prolongando sua toxicidade.
Neste trabalho, quando utilizado DTT, este foi adicionado a todos os tampões, na concentração de 0,005 M, logo no início do processo de purificação. Para fins comparativos do rendimento e recuperação da toxina, partidas de purificação da SYTX foram feitas na ausência e presença de DTT.
4.4.1 – Obtenção do Extrato Total
O esquema de extração das proteínas presentes na farinha do genótipo BR-10 está mostrado na FIGURA 4. A farinha delipidada foi posta em contato com o tampão Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5, na proporção de 1:5 (p/v), deixada sob agitação contínua por 3 h, 4 C, sendo, em seguida, filtrada em pano de trama fina. O resíduo obtido foi re-extraído nessas mesmas condições. Os filtrados foram reunidos e centrifugados a 10.000 x g, 25 minutos, 4 C, sendo o precipitado descartado e o sobrenadante obtido denominado de Extrato Total. Este foi filtrado em papel de filtro e dialisado (“cut-off” MW 12.000) contra tampão Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5.
4.4.2 – Fracionamento com Sulfato de Amônio
A partir da obtenção do extrato total, denominado Preparado A (PREP.A), foram feitas precipitações protéicas nas faixas de 0-20, 20-55, 55- 85% de saturação com sulfato de amônio sólido. Essas frações foram exaustivamente dialisadas contra Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5, tendo em seguida sua toxicidade avaliada. A fração tóxica 20-55% foi denominada de Preparado B (PREP.B), sendo utilizada nas etapas subseqüentes de purificação da SYTX (FIGURA 5).
FIGURA 4 – Esquema de obtenção do extrato total.
FARINHA DE SOJA
DELIPIDADA
Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5, 3 h sob agitação, 4 C
Filtração em pano de trama fina
SOBRENADANTE 1