Internal validity

A amplificação de um fragmento do gene da higromicina fosfotransferase (hpt) a partir de DNA extraído de estirpes obtidas sob pressão de selecção do antibiótico confirma a ocorrência da transformação genética.

A amplificação de um fragmento ham34 + fatss, proveniente da sequência usada para induzir o silenciamento, a partir de DNA extraído de transformantes permite fazer a distinção entre transformantes simples (em que apenas o plasmídeo com o gene de resistência ao antibiótico está presente) e os co-transformantes (em que, além do plasmídeo com o gene hpt, também está presente o plasmídeo com o fragmento de sequência anti-sentido da beta β- cinamomina).

I.2.8.1. Extracção do DNA genómico

O micélio, cultivado em meio líquido durante 4 dias, foi recolhido e lavado cuidadosamente com água destilada esterilizada para retirar todos os vestígios de meio. O excesso de humidade foi retirado através do contacto com papel absorvente. O micélio foi colocado num almofariz e reduzido a pó fino, pela pressão exercida contra as paredes do recipiente com um pilão, após a adição de pequenas quantidades de azoto líquido. A massa macerada e congelada foi pesada e dividida em amostras de 100 mg e transferida para tubos

Eppendorf de 1,5 ml com o auxílio de uma espátula gelada.

Foram, depois, adicionados 400 µl de tampão AP18∗ _{do kit DNeasy}TM

Plant (Qiagen) e

20 µl de uma solução de RNase (20 mg/ml). Esta mistura foi agitada vigorosamente no vórtex, de modo a desfazer os aglomerados, aquecida durante 15 min a 65ºC num banho termostático; durante a reacção a mistura foi energicamente agitada três a quatro vezes. Após este passo de lise, 130 µl de tampão AP28_{foram adicionados e misturados com o lisado, que} foi em seguida arrefecido 5 min em gelo, de modo a precipitar proteínas e polissacáridos.

O lisado, bastante viscoso e contendo DNA, foi aplicado na coluna QIAshredder. A recolha do eluente foi feita num tubo Eppendorf de 2 ml, através de uma centrifugação a 16000 g, durante 2 min.

O sobrenadante recolhido foi, em seguida, transferido para um novo tubo, onde lhe foi

adicionado metade do seu volume em tampão AP38 _{e igual volume de etanol a 100%. 650 µl}

da mistura anterior (incluindo precipitados) foram aplicados numa coluna DNeasy. Esta foi sujeita uma centrifugação durante 1 min a 6000 g e o eluente eliminado. O passo anterior foi repetido para o restante volume da amostra. Por fim, a coluna DNeasy foi colocada num novo tubo, foi lavada com 500 µl de tampão AW8 _{e centrifugada a 6000 g, durante 1 min. O eluente} foi eliminado, 500 µl de tampão AW foram adicionados e a coluna centrifugada a 16000 g, durante 2 min, para secar a membrana da coluna.

A coluna foi transferida para um novo tubo Eppendorf. 50 µl de tampão AE8

,

previamente aquecido a 65ºC, foram directamente pipetados para a membrana da coluna, que foi, em seguida, mantida durante 5 min a ≈ 20ºC e centrifugada a 16000 g durante 1 min. A

8 _{Os tampões indicados fazem parte do kit DNeasy}TM _{Plant (QIAGEN) e a sua composição não é descrita pelo}

Transformação genética de Phytophthora cinnamomi

e silenciamento dos genes das elicitinas Material e Métodos

lavagem da coluna foi repetida para recolher o DNA restante. O DNA foi quantificado por leitura de absorvência a 260 nm e conservado a 4ºC.

I.2.8.2. Reacções de amplificação

As amplificações foram efectuadas em tubos Eppendorf de 500 µl, num volume final de 50 µl duma solução contendo:

- 0,4 µM de cada primer específico

- 10 mM de uma mistura de desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP e dTTP)

- tampão de reacção (Tris-HCl 10 mM; KCl 50 mM; MgCl2 1,5 mM)

- Taq DNA Polimerase (2,5 U) (Boehringer Mannheim) - 100 ng de DNA genómico ou 1 ng de DNA plasmídico.

As temperaturas gerais e o número de ciclos das reacções de PCR estão indicados na Tabela I.11.

Tabela I.11 : Esquema de ciclos e temperaturas de PCR.

N.º de ciclos Função Temperatura (ºC) Tempo 1 Desnaturação inicial da amostra 94 3 min 30

Desnaturação do DNA Hibridação dos primers Polimerização das cadeias de DNA

94 X 72 45 s 45 s 45 s 1 Polimerização final 72 7 min

1 Conservação 4 ∞

Os primers específicos foram sintetizados pela firma GENSET SA. Todos os outros reagentes utilizados foram encomendados a Boehringer Mannheim.

A temperatura de hibridação dos primers (X) foi definida para cada caso.

O controlo negativo das reacções foi constituído por 10 µl de água ultrapura (Milli-Q). Os tubos Eppendorf com a mistura de reacção foram mantidos a 0ºC até serem colocados no termociclador (modelo UNOII da Biometra).

I.2.8.3. Amplificação de um fragmento do gene hpt

O fragmento a ser amplificado foi definido numa zona da sequência codificante (CDS,

Coding Sequence). São conhecidas várias sequências para o gene hpt. Como não se sabia qual

delas foi usada na construção dos plasmídeos usados na transformação, os primers foram escolhidos numa zona de homologia das CDSs entre quatro desses genes publicados no

GenBank (Números de Acesso: U09715, U40398, AF294982 e AF354045) (Ver Anexo 1,

Figura 2).

- Sequência do primer directo: (5’
3’) (18 nt): CGCCGATGGTTTCTACAA - Sequência do primer reverso: (3’
5’) (18 nt): TATCACCTTTGGCTGCGG - Temperatura de hibridação na PCR: 65ºC. Tamanho do fragmento esperado: 839 pb.

I.2.8.4. Amplificação de um fragmento ham34 + fatss

O fragmento cuja presença se pretende confirmar foi definido de modo a amplificar uma parte do promotor do gene ham34 e toda a sequência anti-sentido fatss.

- Sequência do primer directo: (5’
3’) (23 nt): CTTTTGCGTCCTACCATCCGTTA Localização: 398 pb – 420 pb no promotor do gene ham34

- Sequência do primer reverso: (3’
5’) (25 nt): CTACCGCACGCACACTGCCTCGGGG Localização: 382 pb – 406 pb no fragmento fatss

- Temperatura de hibridação na PCR: 65ºC. Tamanho do fragmento esperado: 754 pb.

I.2.8.5. Electroforese em gel de agarose

Os produtos da amplificação por PCR foram analisados por separação electroforética em gel de agarose (1% p/v). Foi adicionado 1 g de agarose em pó a 100 ml de tampão TBE, num Erlenmeyer, e a mistura foi aquecida num forno de microondas até à dissolução da agarose. A solução foi arrefecida até, aproximadamente, 70ºC e foram adicionados 5 µl de uma solução stock de brometo de etídio (10 mg/ml em água). O gel foi vertido no molde, previamente selado e onde foi montado, em seguida um pente (molde dos poços). O gel tinha uma espessura de aproximadamente 5 mm. Após a solidificação do gel, o pente foi retirado e o gel colocado num tanque de electroforese modelo Sub Cell GT (BIORAD). Foi adicionado tampão TBE em volume suficiente para cobrir o gel.

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As amostras de DNA foram misturadas com tampão de amostras (solução de azul de bromofenol com glicerol, 10 µl de amostra + 2 µl de tampão) e colocadas cuidadosamente dentro dos poços, de modo a evitar misturas entre amostras. Para avaliar o comprimento de cada fragmento separado no gel, foi utilizado um marcador de massa molecular de 123 pb ou 1000 pb, em concentrações de 0,1 µg/µl (Invitrogen, 1 µg/µl).

As condições de corrida do gel foram 150 mA (ou 300 V) durante 20 min.

As bandas correspondentes aos fragmentos de DNA foram visualizadas por acção de radiação ultravioleta num transiluminador modelo Gel DOC 2000 (BIORAD). Sempre que a situação o justificava, o gel foi fotografado e analisado com auxílio do programa Quantity

One (BIORAD).